Измерение концентрации ДНК и РНК для ПЦР и NGS: методы, ошибки и практические рекомендации

Зачем точное измерение концентрации критично для молекулярных методов

Контроль концентрации ДНК и РНК является обязательным этапом перед постановкой ПЦР, qPCR и подготовкой NGS библиотек. Ошибки на этом этапе приводят к некорректному расчету входного количества матрицы, снижению чувствительности анализа и нестабильности результатов. Особенно критично это для секвенирования, где отклонения по концентрации напрямую отражаются на равномерности покрытия и качестве данных.
В лабораторной практике часто используется один метод измерения для всех задач, что является распространенной ошибкой. Разные методы анализа имеют различные ограничения и подходят для разных типов образцов.

Спектрофотометрия и ее ограничения

Спектрофотометрический метод основан на измерении оптической плотности при длине волны 260 нм. Он широко распространен благодаря простоте и скорости выполнения, однако имеет существенные ограничения. Спектрофотометр не различает ДНК, РНК, свободные нуклеотиды и другие примеси, поглощающие в том же диапазоне.
При работе с клиническими, FFPE и деградированными образцами спектрофотометрия часто завышает концентрацию. Это приводит к ошибкам при подготовке ПЦР смесей и библиотек для NGS. Использование этого метода допустимо только для предварительной оценки и не рекомендуется для точных расчетов.

Флуориметрия как стандарт для ПЦР и NGS

Флуориметрический метод основан на специфическом связывании красителя с двуцепочечной ДНК или РНК. Это обеспечивает высокую селективность и точность измерений даже при низких концентрациях и наличии примесей.
Продукция Raissol для флуориметрического анализа, включая наборы Spectra Q, позволяет точно определять концентрацию нуклеиновых кислот в диапазонах, актуальных для ПЦР и секвенирования. Такой подход снижает вариабельность между сериями экспериментов и повышает воспроизводимость результатов.
Флуориметрия является обязательным методом при подготовке NGS библиотек, особенно при работе с низким входом ДНК или РНК.

Измерение низких концентраций и деградированных образцов

При работе с клиническими и FFPE образцами концентрация ДНК часто находится на границе чувствительности методов. Использование стандартных протоколов приводит к неточным данным и ошибкам при расчетах.
Наборы Raissol для высокочувствительного флуориметрического анализа адаптированы для работы с низкими концентрациями и деградированной ДНК. Это позволяет корректно оценивать входной материал и избегать избыточной PCR амплификации, которая снижает сложность библиотеки.
Для РНК особое значение имеет минимизация времени между экстракцией и измерением, так как деградация может происходить даже при соблюдении стандартных условий хранения.

Типовые ошибки при измерении концентрации

Одной из наиболее частых ошибок является использование неподходящих стандартов и несоблюдение условий калибровки. Неправильное приготовление стандартов приводит к систематическому смещению результатов.
Другой распространенной проблемой является использование загрязненных или неподходящих пробирок, что влияет на флуоресцентный сигнал. Использование расходных материалов, рекомендованных для флуориметрии, снижает этот риск.
Также важно учитывать, что разные наборы требуют строгого соблюдения протокола по времени инкубации и температуре. Пренебрежение этими параметрами приводит к вариабельности результатов.

Связь контроля концентрации с downstream анализом

Корректное измерение концентрации напрямую влияет на эффективность ПЦР и подготовку NGS библиотек. Избыточное количество ДНК в реакции приводит к неспецифической амплификации, а недостаточное — к слабому сигналу или отсутствию продукта.
При секвенировании ошибки на этапе количественного анализа проявляются в виде неравномерного покрытия, увеличения числа дубликатов и снижения информативности данных. Использование флуориметрических решений Raissol позволяет минимизировать эти риски и повысить стабильность результатов.

Рекомендации по выбору метода измерения

Для рутинной ПЦР допускается использование спектрофотометрии в сочетании с флуориметрическим подтверждением. Для qPCR и NGS флуориметрия является обязательным стандартом.
Лабораториям, работающим с клиническими образцами, рекомендуется использовать флуориметрические наборы одного производителя для обеспечения воспроизводимости и упрощения контроля качества.