ОСНАЩЕНИЕ И УСЛУГИ ДЛЯ НАУЧНЫХ ЛАБОРАТОРИЙ
Html code will be here
Подготовка NGS библиотек:
ключевые этапы, ошибки
и выбор реагентов
Этап 1. Качество исходной ДНК и РНК для подготовки NGS библиотек
Подготовка NGS библиотек напрямую зависит от качества исходной ДНК или РНК. Низкая концентрация, деградация и наличие ингибиторов приводят к нестабильной фрагментации, снижению эффективности лигирования и искажению результатов секвенирования. Поэтому выбор набора для выделения ДНК и реагентов для экстракции РНК должен учитывать дальнейшее применение, а не только получение нуклеиновой кислоты.
Для секвенирования критична сохранность фрагментов и отсутствие остаточных солей, белков и органических соединений. Линейка реагентов Raissol для выделения ДНК из крови, тканей и FFPE образцов оптимизирована под дальнейшую подготовку NGS библиотек. Наборы Blood, Tissue и FFPE MAG позволяют получать ДНК, совместимую с ферментативной фрагментацией и ПЦР амплификацией.
При работе с РНК особое значение имеет подавление РНКаз и минимизация времени обработки образца. Наборы Raissol для экстракции РНК ориентированы на сохранение целостности транскриптов, что критично для RNA-seq и RT-PCR. Использование универсальных наборов без учета специфики РНК часто приводит к деградации и снижению качества данных секвенирования.
Этап 2. Контроль концентрации ДНК и РНК перед подготовкой библиотеки
Корректная оценка концентрации нуклеиновых кислот является обязательным этапом при подготовке NGS библиотек. Ошибки на этом этапе приводят к несоответствию входного количества ДНК требованиям библиотечного набора и, как следствие, к смещению распределения размеров фрагментов.
Спектрофотометрические методы не обеспечивают достаточной точности для NGS, так как учитывают примеси РНК, нуклеотидов и солей. Для подготовки библиотек требуется флуориметрическое измерение концентрации двуцепочечной ДНК.
Продукция Raissol для количественного анализа ДНК, в частности наборы Spectra Q, предназначена для точного измерения концентрации в диапазонах, актуальных для NGS секвенирования. Использование флуориметрических реагентов снижает вариабельность между библиотеками и повышает воспроизводимость при мультиплексировании.
Этап 3. Фрагментация ДНК и подготовка концов
Фрагментация является ключевым этапом формирования NGS библиотеки. Некорректно подобранные условия фрагментации приводят к смещению размеров фрагментов и снижению эффективности секвенирования. Особенно это критично для деградированной ДНК из FFPE образцов.
Ферментативная фрагментация является наиболее распространенным методом, так как обеспечивает воспроизводимость и не требует специализированного оборудования. Библиотечные реагенты Raissol ShotGun GM и ShotGun GM Plus включают оптимизированные ферментные смеси для фрагментации и энд репарации в рамках одного протокола.
Использование комплексных наборов снижает риск ошибок оператора и исключает несовместимость между ферментами разных производителей, что часто встречается при сборке библиотечного протокола из отдельных компонентов.
Этап 4. Лигирование адаптеров и индексирование библиотек
Лигирование адаптеров определяет эффективность загрузки библиотеки на секвенатор. Низкая эффективность лигирования приводит к потере материала, а избыток адаптеров вызывает образование димеров, которые снижают долю полезных ридов.
При выборе реагентов важно учитывать совместимость адаптеров с используемой платформой секвенирования и схемой индексирования. Решения Raissol для подготовки NGS библиотек используют стандартные схемы индексирования, совместимые с распространенными NGS платформами, что упрощает внедрение в существующие лабораторные процессы.
Частой ошибкой является смешивание адаптеров и лигаз разных производителей без предварительной валидации. Использование единых наборов одного бренда снижает вариабельность и повышает воспроизводимость секвенирования.
Этап 5. Очистка библиотек и size selection
Очистка и селекция фрагментов необходимы для удаления адаптеров, ферментов и коротких фрагментов. Магнитные частицы являются стандартом для очистки ПЦР продуктов и библиотек NGS.
Отечественные реагенты Raissol включают магнитные частицы, совместимые с SPRI протоколами. Это позволяет проводить очистку библиотек и size selection с высокой воспроизводимостью и предсказуемым результатом.
Основной ошибкой на этом этапе является некорректное соотношение магнитных частиц и образца, что приводит либо к потере целевых фрагментов, либо к сохранению адаптерных димеров.
Этап 6. Амплификация NGS библиотек и финальный контроль качества
PCR амплификация используется для увеличения количества библиотечного материала при низком входе ДНК. Избыточное число циклов приводит к дубликатам и снижению сложности библиотеки.
Наборы Raissol для ПЦР амплификации обеспечивают стабильную работу без смещения GC состава и подходят для библиотечных протоколов. Контроль количества циклов и обязательная пост PCR очистка являются критическими условиями получения качественной библиотеки.
Финальный контроль качества включает флуориметрическое измерение концентрации и анализ распределения размеров фрагментов. Это позволяет выявить проблемы до загрузки библиотеки на секвенатор и снизить риск неудачного запуска.
Подготовка NGS библиотек напрямую зависит от качества исходной ДНК или РНК. Низкая концентрация, деградация и наличие ингибиторов приводят к нестабильной фрагментации, снижению эффективности лигирования и искажению результатов секвенирования. Поэтому выбор набора для выделения ДНК и реагентов для экстракции РНК должен учитывать дальнейшее применение, а не только получение нуклеиновой кислоты.
Для секвенирования критична сохранность фрагментов и отсутствие остаточных солей, белков и органических соединений. Линейка реагентов Raissol для выделения ДНК из крови, тканей и FFPE образцов оптимизирована под дальнейшую подготовку NGS библиотек. Наборы Blood, Tissue и FFPE MAG позволяют получать ДНК, совместимую с ферментативной фрагментацией и ПЦР амплификацией.
При работе с РНК особое значение имеет подавление РНКаз и минимизация времени обработки образца. Наборы Raissol для экстракции РНК ориентированы на сохранение целостности транскриптов, что критично для RNA-seq и RT-PCR. Использование универсальных наборов без учета специфики РНК часто приводит к деградации и снижению качества данных секвенирования.
Этап 2. Контроль концентрации ДНК и РНК перед подготовкой библиотеки
Корректная оценка концентрации нуклеиновых кислот является обязательным этапом при подготовке NGS библиотек. Ошибки на этом этапе приводят к несоответствию входного количества ДНК требованиям библиотечного набора и, как следствие, к смещению распределения размеров фрагментов.
Спектрофотометрические методы не обеспечивают достаточной точности для NGS, так как учитывают примеси РНК, нуклеотидов и солей. Для подготовки библиотек требуется флуориметрическое измерение концентрации двуцепочечной ДНК.
Продукция Raissol для количественного анализа ДНК, в частности наборы Spectra Q, предназначена для точного измерения концентрации в диапазонах, актуальных для NGS секвенирования. Использование флуориметрических реагентов снижает вариабельность между библиотеками и повышает воспроизводимость при мультиплексировании.
Этап 3. Фрагментация ДНК и подготовка концов
Фрагментация является ключевым этапом формирования NGS библиотеки. Некорректно подобранные условия фрагментации приводят к смещению размеров фрагментов и снижению эффективности секвенирования. Особенно это критично для деградированной ДНК из FFPE образцов.
Ферментативная фрагментация является наиболее распространенным методом, так как обеспечивает воспроизводимость и не требует специализированного оборудования. Библиотечные реагенты Raissol ShotGun GM и ShotGun GM Plus включают оптимизированные ферментные смеси для фрагментации и энд репарации в рамках одного протокола.
Использование комплексных наборов снижает риск ошибок оператора и исключает несовместимость между ферментами разных производителей, что часто встречается при сборке библиотечного протокола из отдельных компонентов.
Этап 4. Лигирование адаптеров и индексирование библиотек
Лигирование адаптеров определяет эффективность загрузки библиотеки на секвенатор. Низкая эффективность лигирования приводит к потере материала, а избыток адаптеров вызывает образование димеров, которые снижают долю полезных ридов.
При выборе реагентов важно учитывать совместимость адаптеров с используемой платформой секвенирования и схемой индексирования. Решения Raissol для подготовки NGS библиотек используют стандартные схемы индексирования, совместимые с распространенными NGS платформами, что упрощает внедрение в существующие лабораторные процессы.
Частой ошибкой является смешивание адаптеров и лигаз разных производителей без предварительной валидации. Использование единых наборов одного бренда снижает вариабельность и повышает воспроизводимость секвенирования.
Этап 5. Очистка библиотек и size selection
Очистка и селекция фрагментов необходимы для удаления адаптеров, ферментов и коротких фрагментов. Магнитные частицы являются стандартом для очистки ПЦР продуктов и библиотек NGS.
Отечественные реагенты Raissol включают магнитные частицы, совместимые с SPRI протоколами. Это позволяет проводить очистку библиотек и size selection с высокой воспроизводимостью и предсказуемым результатом.
Основной ошибкой на этом этапе является некорректное соотношение магнитных частиц и образца, что приводит либо к потере целевых фрагментов, либо к сохранению адаптерных димеров.
Этап 6. Амплификация NGS библиотек и финальный контроль качества
PCR амплификация используется для увеличения количества библиотечного материала при низком входе ДНК. Избыточное число циклов приводит к дубликатам и снижению сложности библиотеки.
Наборы Raissol для ПЦР амплификации обеспечивают стабильную работу без смещения GC состава и подходят для библиотечных протоколов. Контроль количества циклов и обязательная пост PCR очистка являются критическими условиями получения качественной библиотеки.
Финальный контроль качества включает флуориметрическое измерение концентрации и анализ распределения размеров фрагментов. Это позволяет выявить проблемы до загрузки библиотеки на секвенатор и снизить риск неудачного запуска.