ОСНАЩЕНИЕ И УСЛУГИ ДЛЯ НАУЧНЫХ ЛАБОРАТОРИЙ
Real-time PCR — полимеразная цепная реакция в реальном времени
Введение
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) сперва использовали только для амплификации определенных фрагментов ДНК. Позже, благодаря модификации метода и появлению ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), исследователи стали использовать подход и для работы с РНК [1]. С помощью метода можно было проводить лишь качественный анализ. Закономерным развитием для ПЦР стала модификация, позволяющая оценить также количество продукта. Так появился мощный аналитический инструмент — ПЦР в реальном времени [2]. Давайте выясним, как он устроен.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) сперва использовали только для амплификации определенных фрагментов ДНК. Позже, благодаря модификации метода и появлению ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), исследователи стали использовать подход и для работы с РНК [1]. С помощью метода можно было проводить лишь качественный анализ. Закономерным развитием для ПЦР стала модификация, позволяющая оценить также количество продукта. Так появился мощный аналитический инструмент — ПЦР в реальном времени [2]. Давайте выясним, как он устроен.
Основные принципы ПЦР в реальном времени
ПЦР в реальном времени также называют количественной ПЦР. Ключевое отличие от обычной методики — возможность отслеживать ход процесса амплификации в реальном времени. Напомним, что ПЦР — ферментативный процесс, который позволяет in vitro создавать от тысяч до миллионов копий целевых фрагментов генетического кода. Для этого необходима исходная ДНК-матрица образца, праймеры, нуклеотиды (dNTP), термостабильная ДНК-полимераза и буфер для амплификации [3]. Это стандартный набор для ПЦР.
Если же речь идет о ПЦР в реальном времени, то добавляется еще один ключевой компонент — флуоресцентный зонд. Их подразделяют на две основные группы в зависимости от используемого флуоресцентного агента и специфичности ПЦР-детектирования.
Первая группа —молекулы, интеркалирующие двухцепочечную ДНК, что позволяет обнаруживать как специфические, так и неспецифические ампликоны. К этой группе относится SYBR Green и EvaGreen. Во второй группе относятся флуорофоры, которые связаны с олигонуклеотидами. Они обнаруживают только специфические ампликоны [4]. В эту группу входят зонды гидролиза (такие как зонд TaqMan), зонды двойной гибридизации, молекулярные маяки и зонды "скорпионы" [3].
Флуорофор — это флуоресцентная молекула, которая поглощает энергию света определенной длины волны, а затем повторно излучает свет с большей длиной волны. Существует два типа флуорофоров: донорные (или репортерные) и акцепторные (или тушители). Если донорный флуорофор поглощает энергию света, он повышает свой энергетический уровень до уровня возбужденного состояния. Процесс возврата в основное состояние сопровождается выделением энергии в виде флуоресценции, которую и фиксирует фотодетектор амплификатора для ПЦР в реальном времени.
Помимо повышенной точности, чувствительности и быстроты, метод обеспечивает надежную оценку количества наработанного продукта. Он позволяет отслеживать зависимость между изначальным количеством целевой ДНК и количеством синтезированных в ходе реакций ампликонов — копий целевой ДНК [3]. Количество молекул ДНК, доступных в исходной смеси, определяет количество ампликона, генерируемого после заданного количества циклов ПЦР. Если в начале процесса ПЦР присутствует всего несколько молекул ДНК, то ампликонов будет синтезированно относительно мало. Напротив, если исходных молекул большое количество, то и количество продукта будет выше.
Эта особенность метода позволила ему стать одним из основных аналитических инструментов для анализа экспрессии генов при работе с матричной РНК, а также для оценки вирусной нагрузки клинического образца [5, 6]. Стоит вспомнить, что быстрое обнаружения вируса SARS-Cov2 в период пандемии COVID-19 стало возможным в том числе за счет ПЦР в реальном времени.
ПЦР в реальном времени отслеживается благодаря графикам, отражающимся на мониторе подключенного к амплификатору ПК. График отображает кривую накопления продукта ПЦР. В течении первых циклов ПЦР идет наработка продукта, однако его количество, оцениваемое по интенсивности флуоресцентного излучения, не превышает базового уровня. Когда продукт начинает синтезироваться по экспоненте, то кривая на графике резко идет вверх. В этот период достигаются оптимальные условия проведения ПЦР — продукт нарабатывается, и ни один из реагентов не ингибирует прохождение реакции. Интенсивность флуоресценции в экспоненциальной фазе используется для расчета данных. Позднее некоторые реактивы начинают ингибировать ПЦР, запасы нуклеотидов для синтеза заканчиваются, а на графике становится видно, как выработка продукта выходит на плато [7].
ПЦР в реальном времени также называют количественной ПЦР. Ключевое отличие от обычной методики — возможность отслеживать ход процесса амплификации в реальном времени. Напомним, что ПЦР — ферментативный процесс, который позволяет in vitro создавать от тысяч до миллионов копий целевых фрагментов генетического кода. Для этого необходима исходная ДНК-матрица образца, праймеры, нуклеотиды (dNTP), термостабильная ДНК-полимераза и буфер для амплификации [3]. Это стандартный набор для ПЦР.
Если же речь идет о ПЦР в реальном времени, то добавляется еще один ключевой компонент — флуоресцентный зонд. Их подразделяют на две основные группы в зависимости от используемого флуоресцентного агента и специфичности ПЦР-детектирования.
Первая группа —молекулы, интеркалирующие двухцепочечную ДНК, что позволяет обнаруживать как специфические, так и неспецифические ампликоны. К этой группе относится SYBR Green и EvaGreen. Во второй группе относятся флуорофоры, которые связаны с олигонуклеотидами. Они обнаруживают только специфические ампликоны [4]. В эту группу входят зонды гидролиза (такие как зонд TaqMan), зонды двойной гибридизации, молекулярные маяки и зонды "скорпионы" [3].
Флуорофор — это флуоресцентная молекула, которая поглощает энергию света определенной длины волны, а затем повторно излучает свет с большей длиной волны. Существует два типа флуорофоров: донорные (или репортерные) и акцепторные (или тушители). Если донорный флуорофор поглощает энергию света, он повышает свой энергетический уровень до уровня возбужденного состояния. Процесс возврата в основное состояние сопровождается выделением энергии в виде флуоресценции, которую и фиксирует фотодетектор амплификатора для ПЦР в реальном времени.
Помимо повышенной точности, чувствительности и быстроты, метод обеспечивает надежную оценку количества наработанного продукта. Он позволяет отслеживать зависимость между изначальным количеством целевой ДНК и количеством синтезированных в ходе реакций ампликонов — копий целевой ДНК [3]. Количество молекул ДНК, доступных в исходной смеси, определяет количество ампликона, генерируемого после заданного количества циклов ПЦР. Если в начале процесса ПЦР присутствует всего несколько молекул ДНК, то ампликонов будет синтезированно относительно мало. Напротив, если исходных молекул большое количество, то и количество продукта будет выше.
Эта особенность метода позволила ему стать одним из основных аналитических инструментов для анализа экспрессии генов при работе с матричной РНК, а также для оценки вирусной нагрузки клинического образца [5, 6]. Стоит вспомнить, что быстрое обнаружения вируса SARS-Cov2 в период пандемии COVID-19 стало возможным в том числе за счет ПЦР в реальном времени.
ПЦР в реальном времени отслеживается благодаря графикам, отражающимся на мониторе подключенного к амплификатору ПК. График отображает кривую накопления продукта ПЦР. В течении первых циклов ПЦР идет наработка продукта, однако его количество, оцениваемое по интенсивности флуоресцентного излучения, не превышает базового уровня. Когда продукт начинает синтезироваться по экспоненте, то кривая на графике резко идет вверх. В этот период достигаются оптимальные условия проведения ПЦР — продукт нарабатывается, и ни один из реагентов не ингибирует прохождение реакции. Интенсивность флуоресценции в экспоненциальной фазе используется для расчета данных. Позднее некоторые реактивы начинают ингибировать ПЦР, запасы нуклеотидов для синтеза заканчиваются, а на графике становится видно, как выработка продукта выходит на плато [7].
Приложение метода
Метод используется для быстрого обнаружения и количественного определения нуклеиновых кислот в биологических образцах для анализа экспрессии генов, обнаружения мутаций, определения статуса рака, анализа микроРНК, детекции генетически модифицированных организмов, обнаружения и определения количества бактерий, вирусов и измерения вирусной нагрузки. Благодаря своей универсальности метод ПЦР в реальном времени используется во многих областях исследований, включая биомедицину, микробиологию, ветеринарию, сельское хозяйство, фармакологию, биотехнологию и токсикологию [4].
Метод используется для быстрого обнаружения и количественного определения нуклеиновых кислот в биологических образцах для анализа экспрессии генов, обнаружения мутаций, определения статуса рака, анализа микроРНК, детекции генетически модифицированных организмов, обнаружения и определения количества бактерий, вирусов и измерения вирусной нагрузки. Благодаря своей универсальности метод ПЦР в реальном времени используется во многих областях исследований, включая биомедицину, микробиологию, ветеринарию, сельское хозяйство, фармакологию, биотехнологию и токсикологию [4].
Источники
- Templeton N. S. The polymerase chain reaction. History, methods, and applications //Diagnostic molecular pathology: the American journal of surgical pathology, part B. – 1992. – Т. 1. – №. 1. – С. 58-72.
- Kubista M. et al. The real-time polymerase chain reaction //Molecular aspects of medicine. – 2006. – Т. 27. – №. 2-3. – С. 95-125.
- Arya M. et al. Basic principles of real-time quantitative PCR //Expert review of molecular diagnostics. – 2005. – Т. 5. – №. 2. – С. 209-219.
- Navarro E. et al. Real-time PCR detection chemistry //Clinica chimica acta. – 2015. – Т. 439. – С. 231-250.
- Rocha A. J. et al. Guidelines for successful quantitative gene expression in real-time qPCR assays //Polymerase chain reaction for biomedical applications. – 2016. – С. 1-13.
- Riswari S. F. et al. Study of viremic profile in febrile specimens of chikungunya in Bandung, Indonesia //Journal of Clinical Virology. – 2016. – Т. 74. – С. 61-65.
- Wong M. L., Medrano J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation //Biotechniques. – 2005. – Т. 39. – №. 1. – С. 75-85.