ОСНАЩЕНИЕ И УСЛУГИ ДЛЯ НАУЧНЫХ ЛАБОРАТОРИЙ
Html code will be here
РНК-секвенирование (RNA-Seq):
анализ экспрессии генов
в исследованиях и медицине
анализ экспрессии генов
в исследованиях и медицине
RNA-Seq (РНК-секвенирование) – это современная технология секвенирования нового поколения, предназначенная для анализа транскриптома, то есть совокупности всех РНК-молекул, экспрессированных в клетке или образце.
Секвенирование РНК (RNA-Seq) позволяет с высокой точностью измерять, какие гены активны и в каком количестве в образце – на изображении схематично показана двуцепочечная молекула ДНК, являющаяся основой транскриптома.
В отличие от традиционных методов изучения экспрессии генов (например, ПЦР отдельных генов или микроматричного анализа), RNA-Seq позволяет одновременно и без предположений исследовать экспрессию тысяч генов. Это достигается путем секвенирования комплементарной ДНК (кДНК), синтезированной на матрице РНК, с последующим вычислительным анализом количества прочтений, соответствующих каждому гену.
По сути, RNA-Seq даёт цифровой профиль экспрессии генов – сколько РНК от каждого гена присутствует в образце.
Что такое RNA-Seq и зачем он нужен?
RNA-Seq – это метод глубокого высокопроизводительного секвенирования всех молекул РНК в образце. Он отвечает на вопрос, какие гены «включены» и насколько активно они работают в тех или иных условиях.
Основные особенности RNA-Seq:
Анализ экспрессии тысяч генов сразу. Метод не требует знать заранее, какие гены искать – прочитываются все транскрипты, позволяя выявлять новые маркеры и неожиданные изменения в экспрессии.
Высокая чувствительность. RNA-Seq способен обнаруживать даже слабо экспрессируемые транскрипты, недоступные для классических методов.
Широкий динамический диапазон. Цифровое считывание количества РНК дает возможность количественно сравнивать уровни экспрессии (вплоть до десятков тысяч разницы), тогда как микроматричные подходы имеют ограничения по динамическому диапазону.
Детекция разных типов РНК. Можно секвенировать как информационные мРНК, так и некодирующие РНК (микроРНК, длинные некодирующие lncRNA, циркулярные RNA и т.д.), получая полную картину транскриптома.
Стоит отметить, что секвенирование РНК может проводиться либо для тотальной РНК (bulk RNA-Seq), либо для отдельных клеток (Single-cell RNA-Seq). В случае тотального (массового) RNA-Seq данные отражают усредненную экспрессию по миллионам клеток. Это даёт общий профиль, но сглаживает различия между клетками. Одноклеточное секвенирование, напротив, позволяет видеть гетерогенность – какие гены включены в каждой отдельной клетке, что важно, например, в онкологии или эмбриологии. Однако single-cell RNA-Seq технически сложнее и дороже, поэтому bulk RNA-Seq остается востребованным подходом для большинства задач транскриптомики.
Преимущества и возможности RNA-Seq:
Чтобы получить достоверные результаты RNA-Seq, нужно пройти через ряд этапов:
Часто RNA-Seq противопоставляют микроматричному анализу экспрессии генов, который был золотым стандартом 2000-х годов. Микрочипы требуют наличия заранее известных зондов для генов и имеют ограничения по фоновому шуму и диапазону измерения. RNA-Seq не ограничен известными зондами, поэтому способен обнаруживать новые гены или транскрипты, а также более чувствителен к низкоэкспрессированным генам. В одном исследовании было показано, что RNA-Seq выявил в 25% больше дифференциально экспрессированных генов по сравнению с микроматрицей при анализе одних и тех же образцов. Кроме того, RNA-Seq подходит для видов, чей геном еще не полностью аннотирован (можно собирать транскриптом de novo). С другой стороны, микроматричный анализ до сих пор находит применение в клинике (например, ХМА – хромосомный микроматричный анализ для диагностики геномных перестроек) и может быть дешевле при исследовании очень большого числа образцов. Тем не менее, тренд в геномике очевиден: секвенирование транскриптомов постепенно вытесняет чипы благодаря своей информативности и постоянно снижающейся стоимости.
Применение RNA-Seq в науке и медицине
Практически в каждой области биологии сегодня используется RNA-Seq. В онкологии – для поиска специфических для опухоли мишеней (например, выявление аномальной активации сигнальных путей в раковых клетках). В иммунологии – для изучения репертуара антител и рецепторов иммунных клеток (immune-seq). В кардиологии и неврологии – для поиска новых биомаркеров заболеваний через сравнение экспрессии у больных и здоровых.
В клинической генетике все чаще применяют транскриптомный анализ наряду с секвенированием генома, чтобы понять функциональные эффекты мутаций (например, выявить, приводит ли мутация ДНК к нарушению сплайсинга – это видно по наличию аномальных транскриптов на RNA-Seq). Даже фармацевтические компании активно используют RNA-Seq при разработке новых лекарств: технология помогает увидеть, как кандидатное вещество меняет транскриптом клетки-мишени, и предсказать возможные побочные эффекты.
Таким образом, РНК-секвенирование (RNA-Seq) стало незаменимым инструментом молекулярной биологии и биомедицины. Для российских научных учреждений и биотехнологических компаний услуга RNA-Seq открывает доступ к передовым исследованиям экспрессии генов.
В компании «Сесana» секвенирование РНК выполняется «под ключ»: от выделения высококачественной РНК и подготовки библиотек до биоинформатического анализа данных и предоставления подробного отчета. Это особенно актуально, если у вас нет собственных секвенаторов или биоинформатиков – передайте всю работу экспертом. Результатом RNA-Seq будет полный перечень генов, активированных в ваших образцах, и количественная оценка этой активности.
Вы сможете сделать важные выводы и принять научно обоснованные решения – будь то подтверждение гипотезы в фундаментальном исследовании или поиск новых биомаркеров для диагностического теста.
Секвенирование РНК (RNA-Seq) позволяет с высокой точностью измерять, какие гены активны и в каком количестве в образце – на изображении схематично показана двуцепочечная молекула ДНК, являющаяся основой транскриптома.
В отличие от традиционных методов изучения экспрессии генов (например, ПЦР отдельных генов или микроматричного анализа), RNA-Seq позволяет одновременно и без предположений исследовать экспрессию тысяч генов. Это достигается путем секвенирования комплементарной ДНК (кДНК), синтезированной на матрице РНК, с последующим вычислительным анализом количества прочтений, соответствующих каждому гену.
По сути, RNA-Seq даёт цифровой профиль экспрессии генов – сколько РНК от каждого гена присутствует в образце.
Что такое RNA-Seq и зачем он нужен?
RNA-Seq – это метод глубокого высокопроизводительного секвенирования всех молекул РНК в образце. Он отвечает на вопрос, какие гены «включены» и насколько активно они работают в тех или иных условиях.
Основные особенности RNA-Seq:
Анализ экспрессии тысяч генов сразу. Метод не требует знать заранее, какие гены искать – прочитываются все транскрипты, позволяя выявлять новые маркеры и неожиданные изменения в экспрессии.
Высокая чувствительность. RNA-Seq способен обнаруживать даже слабо экспрессируемые транскрипты, недоступные для классических методов.
Широкий динамический диапазон. Цифровое считывание количества РНК дает возможность количественно сравнивать уровни экспрессии (вплоть до десятков тысяч разницы), тогда как микроматричные подходы имеют ограничения по динамическому диапазону.
Детекция разных типов РНК. Можно секвенировать как информационные мРНК, так и некодирующие РНК (микроРНК, длинные некодирующие lncRNA, циркулярные RNA и т.д.), получая полную картину транскриптома.
Стоит отметить, что секвенирование РНК может проводиться либо для тотальной РНК (bulk RNA-Seq), либо для отдельных клеток (Single-cell RNA-Seq). В случае тотального (массового) RNA-Seq данные отражают усредненную экспрессию по миллионам клеток. Это даёт общий профиль, но сглаживает различия между клетками. Одноклеточное секвенирование, напротив, позволяет видеть гетерогенность – какие гены включены в каждой отдельной клетке, что важно, например, в онкологии или эмбриологии. Однако single-cell RNA-Seq технически сложнее и дороже, поэтому bulk RNA-Seq остается востребованным подходом для большинства задач транскриптомики.
Преимущества и возможности RNA-Seq:
- Выявление дифференциальной экспрессии. Сравнивая профили РНК-секвенирования разных образцов (например, больной vs здоровый, опыт vs контроль), исследователи выявляют гены, активность которых изменяется. Такие дифференциально экспрессированные гены могут служить ключами к пониманию механизмов заболеваний или эффектов лечения.
- Новый уровень точности в диагностике. В клинической практике RNA-Seq постепенно внедряется для диагностики сложных случаев. Например, при онкологических заболеваниях транскриптомный анализ опухолевой ткани помогает подобрать таргетную терапию, выявляя экспрессионные «подписи» чувствительности или резистентности к препаратам. Также РНК-секвенирование выявляет мутации и химерные генные слияния, которые не обнаруживаются рутинными методами.
- Открытие новых транскриптов. RNA-Seq регулярно приводит к открытию ранее неаннотированных РНК: новых изоформ генов, длинных некодирующих РНК, циркулярных РНК. Эти находки расширяют наше понимание генома и генетической регуляции. Особенно актуально это стало после того, как оказалось, что большая часть генома транскрибируется в некодирующие РНК, выполняющие регуляторные функции.
- Использование в разных областях. RNA-Seq востребован не только в биомедицине. В агробиотехнологиях его применяют для изучения стрессовых ответов растений (какие гены активируются при засухе, холоде и пр.), в микробиологии – для анализа метатранскриптомов сообществ (активность генов в микробиоте), в фармакологии – для оценки действия новых веществ на клеточные пути. Например, в аграрных исследованиях RNA-Seq помогает понять, какие гены связаны с продуктивностью или устойчивостью пород животных и сортов растений, что важно для селекции.
Чтобы получить достоверные результаты RNA-Seq, нужно пройти через ряд этапов:
- Выделение и контроль качества РНК. Исходным материалом служит тотальная РНК из клеток или тканей. Важно, чтобы РНК была высококачественной, не деградированной – для оценки качества рассчитывают индекс интегритета РНК (RIN). Например, RIN > 6 считается достаточным для секвенирования& Если РНК плохого качества (что бывает с архивными или парафинированными образцами), результаты могут быть неинформативны.
- Подготовка библиотеки кДНК. Чистая РНК сначала превращается в кДНК (обратная транскрипция). Далее выполняется фрагментация и к получившимся фрагментам кДНК добавляются специальные адаптеры. Получается так называемая библиотека секвенирования – набор фрагментов, готовых к загрузке в секвенатор. На этом этапе можно сфокусироваться на определенных типах РНК: например, удалить рибосомные РНК, чтобы усилить долю информативных мРНК, или обогатить образец за счет мРНК с поли-А хвостом (при помощи олиго(dT) методов).
- Секвенирование на платформе NGS. Готовая библиотека считывается на секвенаторе. При секвенировании получаются миллионы коротких прочтений (ридов) длиной ~50–150 пар оснований, соответствующих фрагментам исходных транскриптов.
- Биоинформатический анализ. Сырые прочтения NGS проходят обработку: очистка от технических последовательностей и некачественных участков, выравнивание по референсному геному или сборка транскриптома de novo, подсчет количества ридов на каждый ген. Далее выполняется статистический анализ для выявления дифференциальной экспрессии и биологическая интерпретация результатов (например, какие пути сигнализации активированы). Этот этап крайне важен – без него полученные гигабайты секвенсорных данных не превратятся в понятные отчеты.
Часто RNA-Seq противопоставляют микроматричному анализу экспрессии генов, который был золотым стандартом 2000-х годов. Микрочипы требуют наличия заранее известных зондов для генов и имеют ограничения по фоновому шуму и диапазону измерения. RNA-Seq не ограничен известными зондами, поэтому способен обнаруживать новые гены или транскрипты, а также более чувствителен к низкоэкспрессированным генам. В одном исследовании было показано, что RNA-Seq выявил в 25% больше дифференциально экспрессированных генов по сравнению с микроматрицей при анализе одних и тех же образцов. Кроме того, RNA-Seq подходит для видов, чей геном еще не полностью аннотирован (можно собирать транскриптом de novo). С другой стороны, микроматричный анализ до сих пор находит применение в клинике (например, ХМА – хромосомный микроматричный анализ для диагностики геномных перестроек) и может быть дешевле при исследовании очень большого числа образцов. Тем не менее, тренд в геномике очевиден: секвенирование транскриптомов постепенно вытесняет чипы благодаря своей информативности и постоянно снижающейся стоимости.
Применение RNA-Seq в науке и медицине
Практически в каждой области биологии сегодня используется RNA-Seq. В онкологии – для поиска специфических для опухоли мишеней (например, выявление аномальной активации сигнальных путей в раковых клетках). В иммунологии – для изучения репертуара антител и рецепторов иммунных клеток (immune-seq). В кардиологии и неврологии – для поиска новых биомаркеров заболеваний через сравнение экспрессии у больных и здоровых.
В клинической генетике все чаще применяют транскриптомный анализ наряду с секвенированием генома, чтобы понять функциональные эффекты мутаций (например, выявить, приводит ли мутация ДНК к нарушению сплайсинга – это видно по наличию аномальных транскриптов на RNA-Seq). Даже фармацевтические компании активно используют RNA-Seq при разработке новых лекарств: технология помогает увидеть, как кандидатное вещество меняет транскриптом клетки-мишени, и предсказать возможные побочные эффекты.
Таким образом, РНК-секвенирование (RNA-Seq) стало незаменимым инструментом молекулярной биологии и биомедицины. Для российских научных учреждений и биотехнологических компаний услуга RNA-Seq открывает доступ к передовым исследованиям экспрессии генов.
В компании «Сесana» секвенирование РНК выполняется «под ключ»: от выделения высококачественной РНК и подготовки библиотек до биоинформатического анализа данных и предоставления подробного отчета. Это особенно актуально, если у вас нет собственных секвенаторов или биоинформатиков – передайте всю работу экспертом. Результатом RNA-Seq будет полный перечень генов, активированных в ваших образцах, и количественная оценка этой активности.
Вы сможете сделать важные выводы и принять научно обоснованные решения – будь то подтверждение гипотезы в фундаментальном исследовании или поиск новых биомаркеров для диагностического теста.