ОСНАЩЕНИЕ И УСЛУГИ ДЛЯ НАУЧНЫХ ЛАБОРАТОРИЙ
Как и зачем разрабатывают таргетные панели и в чем преимущество метода?
Введение
Секвенирование нового поколения (NGS) все чаще используется в клинических исследованиях, при изучении биологии рака, для уточнения диагноза, а также в фармацевтических разработках. Столь активное использование технологии для реального медицинского приложения связано с высокой точностью анализа и экономической эффективностью метода. Раньше человек мог потратить до десяти лет жизни, прежде чем ему удавалось поставить диагноз. Такой подход для пациента связан с чрезмерной нагрузкой на бюджет как государства, так и самого больного. Нужен был новый подход, который бы мог в короткие сроки позволить помочь пациенту и снять с него финансовое бремя.
Секвенирование нового поколения (NGS) все чаще используется в клинических исследованиях, при изучении биологии рака, для уточнения диагноза, а также в фармацевтических разработках. Столь активное использование технологии для реального медицинского приложения связано с высокой точностью анализа и экономической эффективностью метода. Раньше человек мог потратить до десяти лет жизни, прежде чем ему удавалось поставить диагноз. Такой подход для пациента связан с чрезмерной нагрузкой на бюджет как государства, так и самого больного. Нужен был новый подход, который бы мог в короткие сроки позволить помочь пациенту и снять с него финансовое бремя.
Что собой представляют таргетные панели и для чего их делать?
Мы уже рассказывали, что существует три основных типа NGS: полногеномное (WGS), полноэкомное (WES) и таргетное (TS), его еще называют целевым. По сравнению с WGS и WES, панели для таргетного секвенирования определяют последовательность только интересующего исследователей кластера генов. Этот метод требуетменьших вычислительных мощностей для обработки результатов [1]. При использовании TS упрощается процесс интерпретации данных и сокращается срок выполнения анализа.
Существуют разные типы целевых вариантов последовательностей, такие как изменение числа копий генов (CNV), генные мутации (в том числе инделы – инсерции и делеции), замены одного нуклеотида (SNV), структурные варианты генов (SV) или эпигенетические изменения ДНК в зародышевой линии и соматические мутации.
Наиболее распространенные клинические приложения TS — определение наследственных заболеваний и исследований опухолей [2]. В последнем случае речь идет не просто о диагностике, но также о прогнозировании течения болезни, мониторинге состояния пациента и отслеживания ответа на терапию. В период пандемии COVID-19 исследователи разработали панели NGS для обнаружения вируса и определения ряда характеристик определенных штаммов. Также, TS используется для мониторинга окружающей среды, например, наличия в почве определенных видов бактерий, характеризующих ее как чистую или загряненную [3].
Образцы опухолей содержат ограниченное количество ДНК и поэтому при их секвенировании необходима большая глубина покрытия. Из-за это особенности, TS подходит для использования в работе с ними лучше, чем, например, аллель-специфическая ПЦР, цифровая ПЦР или секвенирование по Сэнгеру. Кроме того, мутации, вызывающие делеции в участках генов-супрессоров опухоли, происходят на небольших фрагментах ДНК и их сложно обнаружить. Поэтому, именно TS хорошо подходит для их выявления и последующего анализа.
Мы уже рассказывали, что существует три основных типа NGS: полногеномное (WGS), полноэкомное (WES) и таргетное (TS), его еще называют целевым. По сравнению с WGS и WES, панели для таргетного секвенирования определяют последовательность только интересующего исследователей кластера генов. Этот метод требуетменьших вычислительных мощностей для обработки результатов [1]. При использовании TS упрощается процесс интерпретации данных и сокращается срок выполнения анализа.
Существуют разные типы целевых вариантов последовательностей, такие как изменение числа копий генов (CNV), генные мутации (в том числе инделы – инсерции и делеции), замены одного нуклеотида (SNV), структурные варианты генов (SV) или эпигенетические изменения ДНК в зародышевой линии и соматические мутации.
Наиболее распространенные клинические приложения TS — определение наследственных заболеваний и исследований опухолей [2]. В последнем случае речь идет не просто о диагностике, но также о прогнозировании течения болезни, мониторинге состояния пациента и отслеживания ответа на терапию. В период пандемии COVID-19 исследователи разработали панели NGS для обнаружения вируса и определения ряда характеристик определенных штаммов. Также, TS используется для мониторинга окружающей среды, например, наличия в почве определенных видов бактерий, характеризующих ее как чистую или загряненную [3].
Образцы опухолей содержат ограниченное количество ДНК и поэтому при их секвенировании необходима большая глубина покрытия. Из-за это особенности, TS подходит для использования в работе с ними лучше, чем, например, аллель-специфическая ПЦР, цифровая ПЦР или секвенирование по Сэнгеру. Кроме того, мутации, вызывающие делеции в участках генов-супрессоров опухоли, происходят на небольших фрагментах ДНК и их сложно обнаружить. Поэтому, именно TS хорошо подходит для их выявления и последующего анализа.
Как разрабатываются таргетные панели?
Для разработки панелей TS отбираются генетические варианты, ассоциированные с определенными заболеваниями. Например, в случае разработки панели для анализа онкологии важно наличие клеток с разными генетическими вариантами. Какие-то из них, например, могут привести к лекарственной устойчивости опухоли [4]. Большое количество генов, мутации в которых ассоциированы с онкологией, затрудняет разработку панелей, ведь набор генов для них все же ограничен. Следовательно, при разработке онкопанели выбирают гены, которые вносят наибольший вклад в фенотип. Некоторые общедоступные базы данных, такие как GenCC или ClinGen, могут помочь исследователям определить, связаны ли интересующие их гены с заболеванием.
Перед разработкой и использованием панелей таргетного секвенирования необходимо включить дополнительный этап целевого обогащения интересующих фрагментов генома. Его выполняют при помощи избирательного обогащения ампликонов или путем гибридизации [5]. Подробнее об этих подходах вы можете прочитать в другой статье нашего блога — "Особенности и задачи таргетного обогащения". При создании панелей с использованием обогащения на основе ампликонов задействуются заранее разработанные специфические праймеры для амплификации интересующих областей. С другой стороны, в подходе, основанном на гибридизации, ДНК сначала фрагментируется. Затем, для захвата целевой области используются специфичные зонды. Гибридизация может происходить как в твердой, так и в жидкой фазе, при последней в растворе зонды биотинилируются с магнитными шариками стрептавидина [6]. После выбора подхода к обогащению следует амплификация целевого фрагмента, что обеспечивает высокую специфичность для выявлении вариантов последовательности гена при разных заболеваниях [7].
Для разработки панелей TS отбираются генетические варианты, ассоциированные с определенными заболеваниями. Например, в случае разработки панели для анализа онкологии важно наличие клеток с разными генетическими вариантами. Какие-то из них, например, могут привести к лекарственной устойчивости опухоли [4]. Большое количество генов, мутации в которых ассоциированы с онкологией, затрудняет разработку панелей, ведь набор генов для них все же ограничен. Следовательно, при разработке онкопанели выбирают гены, которые вносят наибольший вклад в фенотип. Некоторые общедоступные базы данных, такие как GenCC или ClinGen, могут помочь исследователям определить, связаны ли интересующие их гены с заболеванием.
Перед разработкой и использованием панелей таргетного секвенирования необходимо включить дополнительный этап целевого обогащения интересующих фрагментов генома. Его выполняют при помощи избирательного обогащения ампликонов или путем гибридизации [5]. Подробнее об этих подходах вы можете прочитать в другой статье нашего блога — "Особенности и задачи таргетного обогащения". При создании панелей с использованием обогащения на основе ампликонов задействуются заранее разработанные специфические праймеры для амплификации интересующих областей. С другой стороны, в подходе, основанном на гибридизации, ДНК сначала фрагментируется. Затем, для захвата целевой области используются специфичные зонды. Гибридизация может происходить как в твердой, так и в жидкой фазе, при последней в растворе зонды биотинилируются с магнитными шариками стрептавидина [6]. После выбора подхода к обогащению следует амплификация целевого фрагмента, что обеспечивает высокую специфичность для выявлении вариантов последовательности гена при разных заболеваниях [7].
Заключение
При разработке панели важно знать из каких материалов будет выделена ДНК, ведь от этого зависит какого она будет качества и какая часть от неё дойдет до секвенирования. Например, для тестирования наследственных заболеваний или обнаружения инфекций в основном требуются клетки слизистой или периферической крови, которые не содержат раковых клеток. Напротив, соматическое тестирование обычно проводится после того, как у пациента диагностирован рак, и ожидаемые типы образцов — ткани, фиксированные формалином и залитые в парафин (FFPE), свежезамороженные ткани и внеклеточная ДНК (вкДНК). Наконец, при разработке анализа необходимо также учитывать стратегию биоинформатического анализа, включая выравнивание и определение вариантов генов.
Таргентное секвенирование можно выполнять при помощи секвенаторов Genolab M и FASTASeq 300, представленных в компании "Sesana".
При разработке панели важно знать из каких материалов будет выделена ДНК, ведь от этого зависит какого она будет качества и какая часть от неё дойдет до секвенирования. Например, для тестирования наследственных заболеваний или обнаружения инфекций в основном требуются клетки слизистой или периферической крови, которые не содержат раковых клеток. Напротив, соматическое тестирование обычно проводится после того, как у пациента диагностирован рак, и ожидаемые типы образцов — ткани, фиксированные формалином и залитые в парафин (FFPE), свежезамороженные ткани и внеклеточная ДНК (вкДНК). Наконец, при разработке анализа необходимо также учитывать стратегию биоинформатического анализа, включая выравнивание и определение вариантов генов.
Таргентное секвенирование можно выполнять при помощи секвенаторов Genolab M и FASTASeq 300, представленных в компании "Sesana".
Источники
Bewicke-Copley F. et al. Applications and analysis of targeted genomic sequencing in cancer studies //Computational and structural biotechnology journal. – 2019. – Т. 17. – С. 1348-1359.
Berger M. F., Mardis E. R. The emerging clinical relevance of genomics in cancer medicine //Nature reviews Clinical oncology. – 2018. – Т. 15. – №. 6. – С. 353-365.
John G. et al. Next-generation sequencing (NGS) in COVID-19: a tool for SARS-CoV-2 diagnosis, monitoring new strains and phylodynamic modeling in molecular epidemiology //Current issues in molecular biology. – 2021. – Т. 43. – №. 2. – С. 845-867.
Sagaert X., Vanstapel A., Verbeek S. Tumor heterogeneity in colorectal cancer: what do we know so far? //Pathobiology. – 2018. – Т. 85. – №. 1-2. – С. 72-84.
Mertes F. et al. Targeted enrichment of genomic DNA regions for next-generation sequencing //Briefings in functional genomics. – 2011. – Т. 10. – №. 6. – С. 374-386.
Paskey A. C. et al. Enrichment post-library preparation enhances the sensitivity of high-throughput sequencing-based detection and characterization of viruses from complex samples //BMC genomics. – 2019. – Т. 20. – №. 1. – С. 1-14.
Gaudin M., Desnues C. Hybrid capture-based next generation sequencing and its application to human infectious diseases //Frontiers in microbiology. – 2018. – Т. 9. – С. 2924.
- Bewicke-Copley F. et al. Applications and analysis of targeted genomic sequencing in cancer studies //Computational and structural biotechnology journal. – 2019. – Т. 17. – С. 1348-1359.
- Berger M. F., Mardis E. R. The emerging clinical relevance of genomics in cancer medicine //Nature reviews Clinical oncology. – 2018. – Т. 15. – №. 6. – С. 353-365.
- John G. et al. Next-generation sequencing (NGS) in COVID-19: a tool for SARS-CoV-2 diagnosis, monitoring new strains and phylodynamic modeling in molecular epidemiology //Current issues in molecular biology. – 2021. – Т. 43. – №. 2. – С. 845-867.
- Sagaert X., Vanstapel A., Verbeek S. Tumor heterogeneity in colorectal cancer: what do we know so far? //Pathobiology. – 2018. – Т. 85. – №. 1-2. – С. 72-84.
- Mertes F. et al. Targeted enrichment of genomic DNA regions for next-generation sequencing //Briefings in functional genomics. – 2011. – Т. 10. – №. 6. – С. 374-386.
- Paskey A. C. et al. Enrichment post-library preparation enhances the sensitivity of high-throughput sequencing-based detection and characterization of viruses from complex samples //BMC genomics. – 2019. – Т. 20. – №. 1. – С. 1-14.
- Gaudin M., Desnues C. Hybrid capture-based next generation sequencing and its application to human infectious diseases //Frontiers in microbiology. – 2018. – Т. 9. – С. 2924.
Bewicke-Copley F. et al. Applications and analysis of targeted genomic sequencing in cancer studies //Computational and structural biotechnology journal. – 2019. – Т. 17. – С. 1348-1359.
Berger M. F., Mardis E. R. The emerging clinical relevance of genomics in cancer medicine //Nature reviews Clinical oncology. – 2018. – Т. 15. – №. 6. – С. 353-365.
John G. et al. Next-generation sequencing (NGS) in COVID-19: a tool for SARS-CoV-2 diagnosis, monitoring new strains and phylodynamic modeling in molecular epidemiology //Current issues in molecular biology. – 2021. – Т. 43. – №. 2. – С. 845-867.
Sagaert X., Vanstapel A., Verbeek S. Tumor heterogeneity in colorectal cancer: what do we know so far? //Pathobiology. – 2018. – Т. 85. – №. 1-2. – С. 72-84.
Mertes F. et al. Targeted enrichment of genomic DNA regions for next-generation sequencing //Briefings in functional genomics. – 2011. – Т. 10. – №. 6. – С. 374-386.
Paskey A. C. et al. Enrichment post-library preparation enhances the sensitivity of high-throughput sequencing-based detection and characterization of viruses from complex samples //BMC genomics. – 2019. – Т. 20. – №. 1. – С. 1-14.
Gaudin M., Desnues C. Hybrid capture-based next generation sequencing and its application to human infectious diseases //Frontiers in microbiology. – 2018. – Т. 9. – С. 2924.