ОСНАЩЕНИЕ И УСЛУГИ ДЛЯ НАУЧНЫХ ЛАБОРАТОРИЙ
ОСНАЩЕНИЕ И УСЛУГИ ДЛЯ НАУЧНЫХ ЛАБОРАТОРИЙ
Особенности подходов к забору материала и проведению ПГТ
Впервые ПГТ-А стали использовать в 1993 году для отбора эмбрионов перед имплантацией и улучшения результатов вспомогательных репродуктивных технологий [1]. Сперва скрининг проводился при помощи флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Однако, данный подход не позволял выявлять генные мутации. Необходимость повышения точности анализа и широты охвата возможных патологий привела к разработке различных методов анализа всех хромосом. Для получения более достоверных результатов, в клиническую практику добавились такие методы, как генетическое тестирование методом сравнительной гибридизации на микрочипах (aCGH), секвенирование следующего поколения (NGS) и полимеразная цепная реакция в реальном времени (RT-PCR).
Также исследователи разработали разные подходы к биопсии материала, которые могут применятся в зависимости от показаний и повышать достоверность результатов анализа. Разберем подробнее некоторые разновидности забора материала при проведении ПГТ и его последующий анализ.
Также исследователи разработали разные подходы к биопсии материала, которые могут применятся в зависимости от показаний и повышать достоверность результатов анализа. Разберем подробнее некоторые разновидности забора материала при проведении ПГТ и его последующий анализ.
Биопсия полярных телец
Полярные тельца (ПТ) — побочный продукт, возникающий при мейотическом делении ооцита. Они не несут репродуктивной функции и могут быть отделены от клеток эмбриона, не влияя на его развитие. Биопсия проводится в один или два этапа. Одноэтапная процедура более удобна, поскольку обнаружение пронуклеусов позволяет анализировать только оплодотворенные ооциты, что снижает затраты и потерю времени [2].
При биопсии полярных телец по сути происходит анализ материнской ДНК. И, благодаря тому, что процедура проходит на самых ранних стадиях развития, в ожидании результата нет необходимости замораживать эмбрионы. Это важно, так как цикл заморозки и разморозки может навредить эмбрионам [3]. Такой подход доступен во многих странах с законодательными ограничениями на генетическую оценку и криоконсервацию эмбрионов.
Полярные тельца (ПТ) — побочный продукт, возникающий при мейотическом делении ооцита. Они не несут репродуктивной функции и могут быть отделены от клеток эмбриона, не влияя на его развитие. Биопсия проводится в один или два этапа. Одноэтапная процедура более удобна, поскольку обнаружение пронуклеусов позволяет анализировать только оплодотворенные ооциты, что снижает затраты и потерю времени [2].
При биопсии полярных телец по сути происходит анализ материнской ДНК. И, благодаря тому, что процедура проходит на самых ранних стадиях развития, в ожидании результата нет необходимости замораживать эмбрионы. Это важно, так как цикл заморозки и разморозки может навредить эмбрионам [3]. Такой подход доступен во многих странах с законодательными ограничениями на генетическую оценку и криоконсервацию эмбрионов.
Биопсия бластомера
Биопсия бластомера проводится, когда эмбрион состоит примерно из шести или восьми клеток, что обычно происходит через 72 часа после оплодотворения. При этом возможно удаление одного-двух бластомеров. Биопсия двух клеток более точна, чем одной, но она может повлиять на жизнеспособность эмбриона, поскольку приводит к удалению около 30% всех клеток. С другой стороны, биопсия одной клетки может привести к ошибочному или неправильному диагнозу [4].
Метод совместим с переносом эмбрионов на 5 или 6 день развития. Результаты теста обычно готовы через один-два дня после биопсии бластомера [5].
Биопсия бластомера проводится, когда эмбрион состоит примерно из шести или восьми клеток, что обычно происходит через 72 часа после оплодотворения. При этом возможно удаление одного-двух бластомеров. Биопсия двух клеток более точна, чем одной, но она может повлиять на жизнеспособность эмбриона, поскольку приводит к удалению около 30% всех клеток. С другой стороны, биопсия одной клетки может привести к ошибочному или неправильному диагнозу [4].
Метод совместим с переносом эмбрионов на 5 или 6 день развития. Результаты теста обычно готовы через один-два дня после биопсии бластомера [5].
Биопсия трофоэктодермы
Бластоциста состоит из двух разных типов клеток: внутренней клеточной массы, которая будет развиваться в ткани плода, и трофоэктодермы (ТЭ), считающейся предшественником будущей плаценты. Преимуществ, связанных с биопсией TE, в основном три: во-первых, TE не участвует в формировании плода, поскольку формирует внеэмбриональные ткани. Второе преимущество заключается в том, что анализируется геном эмбриона, а не материнский, что позволяет получать более достоверные результаты [2].
Наконец, для теста необходим образец из пяти-восьми клеток, равный потере около 10% всех клеток, образующих бластоцисты (к тому моменту эмбрион состоит из 100-150 клеток). По сравнению с потерей клеточной массы, обусловленной удалением двух бластомеров, эта процедура кажется гораздо менее инвазивной [6].
Бластоциста состоит из двух разных типов клеток: внутренней клеточной массы, которая будет развиваться в ткани плода, и трофоэктодермы (ТЭ), считающейся предшественником будущей плаценты. Преимуществ, связанных с биопсией TE, в основном три: во-первых, TE не участвует в формировании плода, поскольку формирует внеэмбриональные ткани. Второе преимущество заключается в том, что анализируется геном эмбриона, а не материнский, что позволяет получать более достоверные результаты [2].
Наконец, для теста необходим образец из пяти-восьми клеток, равный потере около 10% всех клеток, образующих бластоцисты (к тому моменту эмбрион состоит из 100-150 клеток). По сравнению с потерей клеточной массы, обусловленной удалением двух бластомеров, эта процедура кажется гораздо менее инвазивной [6].
Молекулярные методы ПГТ
Метод aCGH позволяет выявлять изменения в количестве копий и перестановок каждой из 24 хромосом при сравнении данных биоптатного генетического материала с эталонным образцом. После амплификации при помощи полногеномного секвенирования (WGA) образец метят флуоресцентными зондами и гибридизуют с олигонуклеотидами на микрочипе. Детекция сигнала с микрочипа позволяет выявлять изменения в генетическом коде образца [7].
Для выявления однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) используют WGS. SNP, обнаруженные в анализируемом образце, сравниваются с SNP материнского и отцовского происхождения для поиска изменений в генетическом материале ребенка [8].
В случае NGS, первый этап анализа состоит в проведении WGA, как и в случае aCGH. После амплификации генома происходит процедура штрих-кодирования, при которой разные образцы "помечаются" определенными последовательностями. Затем каждую последовательность сравнивают с эталонным геномом человека при помощи специального ПО [9].
Также для ПГТ используется полимеразная цепная реакция в реальном времени (RT-PCR). При помощи нее исследователи выявляют количество копий специфических ампликонов. В случае наличия у эмбриона дефектного гена, исследователи увидят накопление целевого гена и смогут сделать заключение вероятности развития патологии.
Метод aCGH позволяет выявлять изменения в количестве копий и перестановок каждой из 24 хромосом при сравнении данных биоптатного генетического материала с эталонным образцом. После амплификации при помощи полногеномного секвенирования (WGA) образец метят флуоресцентными зондами и гибридизуют с олигонуклеотидами на микрочипе. Детекция сигнала с микрочипа позволяет выявлять изменения в генетическом коде образца [7].
Для выявления однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) используют WGS. SNP, обнаруженные в анализируемом образце, сравниваются с SNP материнского и отцовского происхождения для поиска изменений в генетическом материале ребенка [8].
В случае NGS, первый этап анализа состоит в проведении WGA, как и в случае aCGH. После амплификации генома происходит процедура штрих-кодирования, при которой разные образцы "помечаются" определенными последовательностями. Затем каждую последовательность сравнивают с эталонным геномом человека при помощи специального ПО [9].
Также для ПГТ используется полимеразная цепная реакция в реальном времени (RT-PCR). При помощи нее исследователи выявляют количество копий специфических ампликонов. В случае наличия у эмбриона дефектного гена, исследователи увидят накопление целевого гена и смогут сделать заключение вероятности развития патологии.
Источники
- Munné S. et al. Fertilization and early embryology: Diagnosis of major chromosome aneuploidies in human preimplantation embryos //Human reproduction. – 1993. – Т. 8. – №. 12. – С. 2185-2191.
- Schmutzler A. G. Theory and practice of preimplantation genetic screening (PGS) //European Journal of Medical Genetics. – 2019. – Т. 62. – №. 8. – С. 103670.
- Delhanty J. D. A. Is the polar body approach best for pre-implantation genetic screening? //Placenta. – 2011. – Т. 32. – С. S268-S270.
- Capalbo A. et al. Sequential comprehensive chromosome analysis on polar bodies, blastomeres and trophoblast: insights into female meiotic errors and chromosomal segregation in the preimplantation window of embryo development //Human Reproduction. – 2013. – Т. 28. – №. 2. – С. 509-518.
- Scott K. L., Hong K. H., Scott Jr R. T. Selecting the optimal time to perform biopsy for preimplantation genetic testing //Fertility and sterility. – 2013. – Т. 100. – №. 3. – С. 608-614.
- De Vos A. et al. Impact of cleavage-stage embryo biopsy in view of PGD on human blastocyst implantation: a prospective cohort of single embryo transfers //Human reproduction. – 2009. – Т. 24. – №. 12. – С. 2988-2996.
- Rodrigo L. et al. New tools for embryo selection: comprehensive chromosome screening by array comparative genomic hybridization //BioMed research international. – 2014. – Т. 2014.
- Northrop L. E. et al. SNP microarray-based 24 chromosome aneuploidy screening demonstrates that cleavage-stage FISH poorly predicts aneuploidy in embryos that develop to morphologically normal blastocysts //MHR: Basic science of reproductive medicine. – 2010. – Т. 16. – №. 8. – С. 590-600.
- Fiorentino F. et al. Development and validation of a next-generation sequencing–based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos //Fertility and sterility. – 2014. – Т. 101. – №. 5. – С. 1375-1382. e2.