Один из наиболее широко используемых интераклирующих агентов — SYBR Green, специфичен для двухцепочечной ДНК. Он связывается с малой бороздкой двойной спирали. В растворе несвязанный краситель тоже флуоресцирует, только очень слабо. После связывания с ДНК, флуоресценция возрастает. SYBR Green остается стабильным в условиях ПЦР, в некоторых случаях его модифицируют при помощи оптического фильтра для гармонизации длин волн возбуждения и излучения. Для обнаружения также можно использовать бромид этидия, но его канцерогенность серьезно ограничивает использование.
Интеркалирующие красители достаточно бюджетны и просты в использовании, но у них есть недостаток — флуоресцентный сигнал могут генерировать как специфические, так и неспецифические продукты. Поэтому, в случае необходимости обнаружить конкретную последовательность нуклеотидов внутри ДНК, прибегают к использованию специфичных зондов. Они представляют собой олигонуклеотидные зонды, меченные красителем и тушителем. Во время ПЦР флуорофор и тушитель разделяются, что приводит к увеличению флуоресценции. Разделение происходит либо путем расщепления олигонуклеотида, либо путем изменения вторичной структуры олигонуклеотидного зонда, когда он отжигается с
ДНК-мишенью [2,3]. Альтернативный подход к обнаружению и количественному определению нуклеиновых кислот использует фрагменты репортера и тушителя, прикрепленные непосредственно к праймерам ПЦР вместо
гибридизационного зонда [4].
Олигонуклеотидные зонды, меченные красителем и тушителем есть нескольких типов
[5]:
- TaqMan. Подобные зонды представляют собой небольшой олигонуклеотид, комплементарный фрагменту ДНК. В его состав входит репортер и гаситель, это два отдельных флуорофора. Когда они расположены рядышком, то гаситель не позволяет зафиксировать свечение репортера. Но при амплификации ДНК-полимераза нарушает целостность зонда и свечение может быть зафиксировано датчиками прибора.
- Молекулярные маяки. Они представляют собой одноцепочечные фрагменты ДНК с петелькой, похожей на шпильку. На концах, также, как и в случае TaqMan "сидят" репортер и гаситель. В этом случае флуоресценция считывается прибором уже на этапе отжига праймеров.
- Праймеры-скорпионы. По структуре они похожи на маяки, только на после гасителя в довесок еще следует праймер, с которого и начинается амплификация. Флуоресценция считывается на этапе отжига праймера. Только шпилька зонда, подобно хвосту скорпиона соединяется с ДНК, синтезированной с присоединенного праймера.