ОСНАЩЕНИЕ И УСЛУГИ ДЛЯ НАУЧНЫХ ЛАБОРАТОРИЙ
ОСНАЩЕНИЕ И УСЛУГИ ДЛЯ НАУЧНЫХ ЛАБОРАТОРИЙ
Подробнее о методиках для НИПТ
Метод НИПТ (неинвазивное пренатальное тестирование) заключается в обнаружении внеклеточной ДНК (вкДНК) плода в крови матери и детекции патологий на основе ее анализа. В среднем, между 10 и 20 неделей беременности фетальная фракция вкДНК составляет 10-15% от всей вкДНК в крови матери [1]. Существует несколько подходов к выявлению и анализу фетальной фракции внеклеточной ДНК. Расскажем подробнее о некоторых из них.Начнем с общих этапов генетического анализа.
Общие этапы разных подходов к проведению НИПТ
Все подходы к проведению НИПТ включают в себя секвенирование последовательности ДНК. Для этого необходимо выполнить следующие шаги:
Подготовка библиотеки ДНК. Процесс состоит из таких этапов, как восстановление концов ДНК, лигирование адаптеров и ПЦР-амплификация. В целом, подготовка представляет собой стандартную процедуру.
Секвенирование. Проведению секвенирования предшествует оценка качества библиотеки. В случае, если библиотека соответствует стандартам качества и концентрация ДНК в образце достаточная, можно приступать к секвенированию.
Биоинформатический анализ данных. Полученные данные сравниваются с эталонной последовательностью генома для обнаружения отличий и выявления моногенных патологий. В случае с анеуплоидиями в первую очередь оценивается количество ДНК для детекции избыточного генетического материала.
Все подходы к проведению НИПТ включают в себя секвенирование последовательности ДНК. Для этого необходимо выполнить следующие шаги:
- Взятие крови и экстракция ДНК. Примерно 5–10 мл образца периферической венозной крови берется в пробирку с ЭДТА. Существуют разные наборы для выделения ДНК, проводить процедуру следует в соответствии с протоколом производителя. На сайте компании Сесана представлены наборы для выделения российского производства Raissol, там же можно найти инструкцию по эксплуатации, чтобы подробнее узнать о процедуре. Экстрагированная бесклеточная ДНК, которая содержит как материнские, так и плодные бесклеточные фрагменты ДНК, впоследствии используется для приготовления библиотек для секвенирования [2].
- Подготовка библиотеки ДНК. Процесс состоит из таких этапов, как восстановление концов ДНК, лигирование адаптеров и ПЦР-амплификация. В целом, подготовка представляет собой стандартную процедуру.
- Секвенирование. Проведению секвенирования предшествует оценка качества библиотеки. В случае, если библиотека соответствует стандартам качества и концентрация ДНК в образце достаточная, можно приступать к секвенированию.
- Биоинформатический анализ данных. Полученные данные сравниваются с эталонной последовательностью генома для обнаружения отличий и выявления моногенных патологий. В случае с анеуплоидиями в первую очередь оценивается количество ДНК для детекции избыточного генетического материала.
Подготовка библиотеки ДНК. Процесс состоит из таких этапов, как восстановление концов ДНК, лигирование адаптеров и ПЦР-амплификация. В целом, подготовка представляет собой стандартную процедуру.
Секвенирование. Проведению секвенирования предшествует оценка качества библиотеки. В случае, если библиотека соответствует стандартам качества и концентрация ДНК в образце достаточная, можно приступать к секвенированию.
Биоинформатический анализ данных. Полученные данные сравниваются с эталонной последовательностью генома для обнаружения отличий и выявления моногенных патологий. В случае с анеуплоидиями в первую очередь оценивается количество ДНК для детекции избыточного генетического материала.
Полногеномное секвенирование (WGS – whole genome sequencing)
Массово-параллельное опознавательное секвенирование (massively parallel signature sequencing, MPSS) — один из первых подходов, который начали применять для секвенирования вкДНК, выделенной из крови беременной женщины [3]. Он позволяет быстро и секвенировать десятки миллионов небольших фрагментов ДНК за один запуск. Анеуплоидия хромосомы у плода определяется по количеству прочтений последовательностей, полученных с интересующей хромосомы, по сравнению с количеством прочтений, полученными с референсных хромосом.
Препятствовать точному анализу при использовании полногеномного секвенирования может количество образцов, анализируемых одновременно и качество выделенной ДНК. При работе с большим количеством образцов возрастает вероятность ошибки, в том числе и в процессе выделения, что неизбежно скажется на качестве последующих этапов анализа. К достоинствам метода относится то, что НИПТ на основе полногеномного секвенирования позволяет упростить и ускорить лабораторный процесс, в случае работы с большим потоком образцов, а также снизить сложность анализа, поскольку не требуется этап обогащения.
Массово-параллельное опознавательное секвенирование (massively parallel signature sequencing, MPSS) — один из первых подходов, который начали применять для секвенирования вкДНК, выделенной из крови беременной женщины [3]. Он позволяет быстро и секвенировать десятки миллионов небольших фрагментов ДНК за один запуск. Анеуплоидия хромосомы у плода определяется по количеству прочтений последовательностей, полученных с интересующей хромосомы, по сравнению с количеством прочтений, полученными с референсных хромосом.
Препятствовать точному анализу при использовании полногеномного секвенирования может количество образцов, анализируемых одновременно и качество выделенной ДНК. При работе с большим количеством образцов возрастает вероятность ошибки, в том числе и в процессе выделения, что неизбежно скажется на качестве последующих этапов анализа. К достоинствам метода относится то, что НИПТ на основе полногеномного секвенирования позволяет упростить и ускорить лабораторный процесс, в случае работы с большим потоком образцов, а также снизить сложность анализа, поскольку не требуется этап обогащения.
Целевой анализ генома — НИПТ на основе SNP
SNP (single nucleotide polymorphism) — однобуквенные отличия между геномами разных организмов одного вида. В случае НИПТ, анализ SNP будет определять различия в геноме плода и родителей. НИПТ на основе SNP предполагает мультиплексную амплификацию последовательностей, проводимую на основе ДНК, выделенной из плазмы крови, с последующим секвенированием нового поколения [4].
НИПТ для детекции SNP может применяться для выявления трисомий 13, 18, 21 хромосомы и синдромов, связанных с микроделециями, а также для скрининга моногенных заболеваний.
SNP (single nucleotide polymorphism) — однобуквенные отличия между геномами разных организмов одного вида. В случае НИПТ, анализ SNP будет определять различия в геноме плода и родителей. НИПТ на основе SNP предполагает мультиплексную амплификацию последовательностей, проводимую на основе ДНК, выделенной из плазмы крови, с последующим секвенированием нового поколения [4].
НИПТ для детекции SNP может применяться для выявления трисомий 13, 18, 21 хромосомы и синдромов, связанных с микроделециями, а также для скрининга моногенных заболеваний.
Целевой анализ генома — НИПТ на основе микрочипов
В этой технологии зонды, нацеленные на определенные последовательности генома, синтезируются и крепятся в отдельных ячейках микрочипа. Сперва следует наработка целевых фрагментов вкДНК при помощи ПЦР. Затем они помечаются флуоресцентным зондом и связываются с комплементарными последовательностями на микрочипе. Считывание сигнала благодаря флуоресцентным зондам, позволяет определить относительную представленность хромосом и анеуплоидию.
При проведении НИПТ с использованием микрочипа также могут присутствовать ошибки обогащения, приводящие к неправильному результату. Несмотря на это, технология обеспечивает высокий уровень мультиплексирования, масштабируема и экономически эффективна. В настоящее время эта технология доступна для выявления трисомий 13, 18, 21 хромосом и ряда отдельных синдромов [5].
В этой технологии зонды, нацеленные на определенные последовательности генома, синтезируются и крепятся в отдельных ячейках микрочипа. Сперва следует наработка целевых фрагментов вкДНК при помощи ПЦР. Затем они помечаются флуоресцентным зондом и связываются с комплементарными последовательностями на микрочипе. Считывание сигнала благодаря флуоресцентным зондам, позволяет определить относительную представленность хромосом и анеуплоидию.
При проведении НИПТ с использованием микрочипа также могут присутствовать ошибки обогащения, приводящие к неправильному результату. Несмотря на это, технология обеспечивает высокий уровень мультиплексирования, масштабируема и экономически эффективна. В настоящее время эта технология доступна для выявления трисомий 13, 18, 21 хромосом и ряда отдельных синдромов [5].
Источники
- Palomaki G. E. et al. DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an international clinical validation study //Genetics in medicine. – 2011. – Т. 13. – №. 11. – С. 913-920.
- Srinivasan A. et al. Noninvasive detection of fetal subchromosome abnormalities via deep sequencing of maternal plasma //The American Journal of Human Genetics. – 2013. – Т. 92. – №. 2. – С. 167-176.
- Chiu R. W. K. et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma //Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2008. – Т. 105. – №. 51. – С. 20458-20463.
- Kurtser M. A., Gnetetskaya V. A. A noninvasive prenatal test in the diagnosis of chromosome aneuploidies //Akusherstvo i ginekologiya/Obstetrics and Gynecology. – 2015. – Т. 8. – С. 65-9.
- Stokowski R. et al. Clinical performance of non‐invasive prenatal testing (NIPT) using targeted cell‐free DNA analysis in maternal plasma with microarrays or next generation sequencing (NGS) is consistent across multiple controlled clinical studies //Prenatal diagnosis. – 2015. – Т. 35. – №. 12. – С. 1243-1246.