ОСНАЩЕНИЕ И УСЛУГИ ДЛЯ НАУЧНЫХ ЛАБОРАТОРИЙ
Одноклеточное секвенирование РНК
Введение
При полногеномном секвенировании (WGS) исследуется усредненный геном популяции клеток. Это может быть клеточная культура, конкретная ткань, орган или образцы из разных тканей. Секвенирование отдельных клеток позволяет изучать характеристики конкретной клетки с ее специфическими особенностями [1]. Такой подход используется для выявления новых мутаций в опухолях, изучения вариаций эпигенома, происходящих во время эмбрионального развития (и не только!) и оценки экспрессии определенных генов в конкретных клетках. То есть, традиционно секвенирование отдельных клеток подразделяется на: изучение генома клетки (scDNA-seq), ее метилома или же транскриптома (scRNA-seq). О последнем и пойдет речь в новом материале.
При полногеномном секвенировании (WGS) исследуется усредненный геном популяции клеток. Это может быть клеточная культура, конкретная ткань, орган или образцы из разных тканей. Секвенирование отдельных клеток позволяет изучать характеристики конкретной клетки с ее специфическими особенностями [1]. Такой подход используется для выявления новых мутаций в опухолях, изучения вариаций эпигенома, происходящих во время эмбрионального развития (и не только!) и оценки экспрессии определенных генов в конкретных клетках. То есть, традиционно секвенирование отдельных клеток подразделяется на: изучение генома клетки (scDNA-seq), ее метилома или же транскриптома (scRNA-seq). О последнем и пойдет речь в новом материале.
Одноклеточное секвенирование РНК
Зачем секвенировать отдельные клетки?
Каждая клетка в ткани или органе может по-разному влиять на развитие патологии или реагировать на терапию. Секвенирование отдельных клеток помогает оценить их индивидуальный вклад в конкретный процесс. Подобный уровень детализации особенно ценен при изучении редких типов клеток или же вариаций фенотипа в популяциях одного типа клеток. Так, метод используется для измерения состава и структуры микробиомов человека, изучения происхождение и развития резистентности к химиотерапии опухолевых клеток или, например, исследования неизвестных функций генов растений [2, 3, 4].
Комбинирование такого секвенирования с другими методами может дать еще более обширные сведения. Так называемые омиксные технологии позволяют сочетать данные по геному, эпигеному, протеому, метилому и транскриптому клеток, тем самым максимально точно объясняя происходящие в них процессы [5]. Не последнюю роль в работе с огромным пулом данных играют инновационные подходы анализа на основе машинного обучения [6].
Каждая клетка в ткани или органе может по-разному влиять на развитие патологии или реагировать на терапию. Секвенирование отдельных клеток помогает оценить их индивидуальный вклад в конкретный процесс. Подобный уровень детализации особенно ценен при изучении редких типов клеток или же вариаций фенотипа в популяциях одного типа клеток. Так, метод используется для измерения состава и структуры микробиомов человека, изучения происхождение и развития резистентности к химиотерапии опухолевых клеток или, например, исследования неизвестных функций генов растений [2, 3, 4].
Комбинирование такого секвенирования с другими методами может дать еще более обширные сведения. Так называемые омиксные технологии позволяют сочетать данные по геному, эпигеному, протеому, метилому и транскриптому клеток, тем самым максимально точно объясняя происходящие в них процессы [5]. Не последнюю роль в работе с огромным пулом данных играют инновационные подходы анализа на основе машинного обучения [6].
Single cell RNA sequence — как оно работает?
Технология секвенирования отдельных клеток требует четырех основных этапов:
Второй возможный подход — магнитно-активируемая клеточная сортировка (MACS) [8]. В этом случае, исследователи используют наночастицы и антитела для маркировки специфических белков на клетках-мишенях. Затем внешнее магнитное поле позволяет отделить меченные клетки, в то время как остальные вымываются. Ограничение метода — клетки отбираются только на основе поверхностных белков, и "чистота" изолированных клеток основывается на специфичности антител, используемых для мечения. Возможна также ручная изоляция клеток, для чего необходим инвертированный микроскоп и микропипетки для отбора [9].
Перед тем, как приступить к следующему этапу, исследователи оценивают качество изолированных клеток и их жизнеспособность при помощи методов визуализации. Также они могут сразу оценить целостность молекул РНК в изолированных клетках. Затем изолированные клетки лизируют, после чего следует этап выделения и амплификации РНК, что обеспечивает достаточное количество исследуемых молекул в образце.
Дополнительный шаг — обогащение молекул РНК поли[Т]-праймерами. Это позволяет отделить матричную РНК от рибосомальной, которая обычно не представляет интереса при изучении транскриптома. Конечный материал для последующего секвенирования — ДНК, поэтому при необходимости исследовать именно транскриптом, добавляется еще один этап работы — перевод выделенных из клетки молекул РНК в кДНК при помощи обратной транскриптазы [10].
Затем следует стандартный процесс подготовки библиотеки. В случае секвенирования РНК отдельных клеток — библиотека представляет собой набор фрагментов нуклеиновых кислот, выделенных из одной клетки. Если же секвенируют последовательности из нескольких клеток, после амплификации фрагменты ДНК маркируются уникальным штрих-кодом (специфичным адаптером), которые позволит затем определить какой фрагмент принадлежит той или иной клетке.
После подготовки библиотеки настает черед секвенирования. Подробнее о методах секвенирования можно узнать в статье — "Обзор методов секвенирования". Следующий этап — анализ полученных данных, который позволит, наконец, узнать особенности интересующих исследователей клеток.
Технология секвенирования отдельных клеток требует четырех основных этапов:
- выделения одиночных клеток из клеточной популяции;
- выделения РНК из каждой изолированной клетки и перевода ее в кДНК;
- подготовки библиотеки для секвенирования с использованием изолированного материала;
- секвенирования транскриптома отдельных клеток.
Второй возможный подход — магнитно-активируемая клеточная сортировка (MACS) [8]. В этом случае, исследователи используют наночастицы и антитела для маркировки специфических белков на клетках-мишенях. Затем внешнее магнитное поле позволяет отделить меченные клетки, в то время как остальные вымываются. Ограничение метода — клетки отбираются только на основе поверхностных белков, и "чистота" изолированных клеток основывается на специфичности антител, используемых для мечения. Возможна также ручная изоляция клеток, для чего необходим инвертированный микроскоп и микропипетки для отбора [9].
Перед тем, как приступить к следующему этапу, исследователи оценивают качество изолированных клеток и их жизнеспособность при помощи методов визуализации. Также они могут сразу оценить целостность молекул РНК в изолированных клетках. Затем изолированные клетки лизируют, после чего следует этап выделения и амплификации РНК, что обеспечивает достаточное количество исследуемых молекул в образце.
Дополнительный шаг — обогащение молекул РНК поли[Т]-праймерами. Это позволяет отделить матричную РНК от рибосомальной, которая обычно не представляет интереса при изучении транскриптома. Конечный материал для последующего секвенирования — ДНК, поэтому при необходимости исследовать именно транскриптом, добавляется еще один этап работы — перевод выделенных из клетки молекул РНК в кДНК при помощи обратной транскриптазы [10].
Затем следует стандартный процесс подготовки библиотеки. В случае секвенирования РНК отдельных клеток — библиотека представляет собой набор фрагментов нуклеиновых кислот, выделенных из одной клетки. Если же секвенируют последовательности из нескольких клеток, после амплификации фрагменты ДНК маркируются уникальным штрих-кодом (специфичным адаптером), которые позволит затем определить какой фрагмент принадлежит той или иной клетке.
После подготовки библиотеки настает черед секвенирования. Подробнее о методах секвенирования можно узнать в статье — "Обзор методов секвенирования". Следующий этап — анализ полученных данных, который позволит, наконец, узнать особенности интересующих исследователей клеток.
Заключение
Основное отличие одноклеточного секвенирования РНК от других типов определения последовательности нуклеиновых кислот происходит на этапе пробоподготовки. Из-за особенностей технологии секвенатор работает только с молекулами ДНК, что требует "перевода" последовательности РНК в кДНК. Одноклеточное секвенирование РНК, несмотря на относительную "юность" методики, нашло уже множество приложений, как в фундаментальной науке, так и в прикладной, особенно в изучении экспрессии генов опухолевых клеток.
Основное отличие одноклеточного секвенирования РНК от других типов определения последовательности нуклеиновых кислот происходит на этапе пробоподготовки. Из-за особенностей технологии секвенатор работает только с молекулами ДНК, что требует "перевода" последовательности РНК в кДНК. Одноклеточное секвенирование РНК, несмотря на относительную "юность" методики, нашло уже множество приложений, как в фундаментальной науке, так и в прикладной, особенно в изучении экспрессии генов опухолевых клеток.
Источники
- Tang X. et al. The single-cell sequencing: new developments and medical applications //Cell & bioscience. – 2019. – Т. 9. – С. 1-9.
- Balachandran M., Cross K. L., Podar M. Single-cell genomics and the oral microbiome //Journal of Dental Research. – 2020. – Т. 99. – №. 6. – С. 613-620.
- Kim C. et al. Chemoresistance evolution in triple-negative breast cancer delineated by single-cell sequencing //Cell. – 2018. – Т. 173. – №. 4. – С. 879-893. e13.
- Wendrich J. R. et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions //Science. – 2020. – Т. 370. – №. 6518. – С. eaay4970.
- Granja J. M. et al. Single-cell multiomic analysis identifies regulatory programs in mixed-phenotype acute leukemia //Nature biotechnology. – 2019. – Т. 37. – №. 12. – С. 1458-1465.
- Erfanian N. et al. Deep Learning Applications in Single-Cell Omics Data Analysis. bioRxiv 2021 //Google Scholar.
- Gross A. et al. Technologies for single-cell isolation //International journal of molecular sciences. – 2015. – Т. 16. – №. 8. – С. 16897-16919.
- Welzel G., Seitz D., Schuster S. Magnetic-activated cell sorting (MACS) can be used as a large-scale method for establishing zebrafish neuronal cell cultures //Scientific reports. – 2015. – Т. 5. – №. 1. – С. 7959.
- Citri A. et al. Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells //Nature protocols. – 2012. – Т. 7. – №. 1. – С. 118-127.
- Hess J. F. et al. Library preparation for next generation sequencing: A review of automation strategies //Biotechnology advances. – 2020. – Т. 41. – С. 107537.