Секвенирование тотальной РНК

В чем отличия от одноклеточного секвенирования РНК?

Секвенирование тотальной РНК основано на усреднении данных экспрессии генов в популяции клеток для выявления присутствия РНК, а также ее количества в образце в момент его забора. Тотальное секвенирование РНК требует соблюдения ряда условий для получения данных высокого качества.

Как и в случае с одноклеточным секвенированием РНК, для получения достоверных данных необходимо правильно провести пробоподготовку и подготовку библиотеки. Рабочий процесс можно условно разделить на выделение РНК из образца, обогащение РНК и синтез кДНК. Работу с РНК значительно осложняет ее одноцепочечная структура: молекула хрупкая, нестабильная, подвергается гидролизу и термической деградации [1].

Перед секвенированием оценивается качество РНК, для чего используют число целостности РНК (RIN — RNA integrity number), величиной от 1 до 10 [2]. При этом значение выше 6 считается достаточным для секвенирования [3]. РНК самого низкого качества обычно выделяют из образцов, полученных при помощи биопсии и помещенных после в парафиновые блоки. Не стоит забывать и о том, что при заморозке РНК со временем теряет целостность, поэтому RIN обычно оценивают непосредственно перед подготовкой библиотеки. В большинстве случаев не требуется большого количества РНК в образце для секвенирования, но все же встречаются методики при использовании которых значительная концентрация — принципиальная характеристика.

Слово "тотальное" — подразумевает общий источник РНК в клеточной популяции для усредненной оценки транскриптома. При этом нельзя исключать возможности изоляции определенных типов РНК из всего пула. Существуют разные подходы выборочного обогащения образца по типу РНК. Перед созданием библиотеки рекомендуется удалять транскрипты рРНК из-за их значительного присутствия в образце по сравнению с другими типами РНК, а также их наименьшей информативности [4].

В случае фокуса исследователя на мРНК, кодирующих белок, протоколы модифицированы таким образом, чтобы обогатить мРНК при помощи поли(Т)-олигонуклеотидов, нацеленных на поли(А)-хвосты молекул. При внимании к некодирующей РНК, также стараются максимально убрать из образца рРНК. Это помогает обнаружить максимальное количество пре-мРНК, которые еще не прошли процессинг — не превратились из первичного транскрипта в зрелую РНК.

Другие подходы позволяют уделить внимание малым РНК — ключевым регуляторам экспрессии генов. Длина малых РНК — от 15 до 30 нуклеотидов, и что примечательно, они не прошли этап присоединения поли(А)-хвоста. Эта особенность подтолкнула ученых к разработке отдельных протоколов для пробоподготовки образцов с малыми РНК. Чаще всего РНК в таких образцах выделяют при помощи спин-колонок с силикагелем.

Для секвенирования тотальной РНК лучше использовать протоколы секвенирования с длинными ридами (прочтениями) — около 10 000 пар нуклеотидов. Такой размер ридов позволяет наиболее полно охватить весь транскриптом образца. Однако, у этого метода может быть низкая точность, возникающая уже на этапе предварительной обработки образца из-за высокой скорости деградации РНК.

Недостаток тотального секвенирования — отсутствие способности обнаружения различий в экспрессии генов между отдельными клетками в популяции. Именно поэтому всегда велика вероятность упустить как незначительные, так и важные отличия. С другой стороны, как раз для этого и было разработано одноклеточное секвенирование, о котором можно прочитать подробнее в другом материале.


Применение тотального секвенирования РНК

В первую очередь тотальное секвенирование РНК выбирают, если необходимо изучить профили экспрессии генов в тканях и органах. Метод позволяет исследовать и сравнивать паттерны экспрессии в случае, если проводится ряд экспериментов или для отслеживания результатов на терапию. Такой подход особенно актуален при задействовании в лечении экспериментальных препаратов или при необходимости выяснить причину отсутствия ответа на лечение.

Другое частое приложение метода — дифференциальный анализ, который позволяет узнать подробнее о молекулярных путях и биологических процессах в тканях, связанных с конкретным состоянием организма. Это особенно важно при выяснении причины патологии на молекулярном уровне в сложных случаях, когда не удается на основе биохимического анализа выяснить, в чем причина болезни. Также, секвенирование тотальной РНК проводят, если необходимо аннотировать транскримптом — идентифицировать конкретные транскрипты, изоформы, некодирующие РНК или даже для уточнения существующих аннотаций генома для поввышения качества данных.

Помимо этого, метод используют для анализа альтернативного сплайсинга. Полученные данные позволяют выявить функциональные последствия альтернативного сплайсинга и его регуляции [5].

Последний вариант для использования тотального секвенирования РНК — необходимость идентифицировать слияние генов, которые часто становятся причиной развития онкологии [6]. Это необходимо для уточнения диагноза и подбора терапии.


Заключение

В зависимости от целей, исследователь делает выбор в пользу того или иного метода. При секвенировании тотальной РНК в большинстве случаев необходима общая оценка характеристик транскриптома, что нужно как исследовательских проектах, так и в медицине.

Для секвенирования тотальной РНК хорошо подходит секвенатор Genolab M. Он отличается высоким качеством данных на выходе и подходит для работы с библиотеками, в которых длины фрагментов начинаются от 250 п.н.. Метод тотального секвенирования используется как в фундаментальных исследованиях, так и в клинической диагностике. Он позволяет оценить молекулярные особенности процессов, происходящих в тканях, и на основе полученных данных дать им характеристику, которая пригодится при оценке ответа на терапию.

#новости_науки