Основные приложения секвенирования в науке и медицине

Полногеномное

Полногеномное секвенирование (секвенирование всего генома, WGS) — определение всей последовательности геномной ДНК за один раз. Вместе с геномной ДНК секвенируют и ДНК митохондрий, а если речь идет о растениях — то и хлоропластов. В результате ученые получают смесь фрагментов (ридов) всего генома организма [1].


Геном играет ключевую роль в современных исследованиях. Полногеномное секвенирование можно использовать как для создания эталонной последовательности генома (которую затем применяют в качестве образца для сравнения), так и для анализа конкретного генома организма. Такой подход позволяет выявлять различные типы биомаркеров ДНК, включая однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) — точечные мутации, вставки или делеции участков последовательности (indels), структурные вариации (SV), вариации числа копий (CNV) и другие изменения в последовательности генома.

Кроме того, полногеномное секвенирование активно используется для поиска полиморфизмов внутри популяции, что способствует изучению эволюции и развития вида. Анализ генома позволяет глубже понять, как различные изменения в последовательности влияют на организм.

Полногеномный поиск ассоциаций (GWAS) также опирается на анализ генома. Он необходим для выявления связи между изменениями в геноме и определёнными фенотипами. Эти исследования активно применяются не только в биологии, но и в таких отраслях, как сельское хозяйство, фармацевтика, персонализированная медицина и оценка пищевой безопасности.
Изучение генома и его вариаций открывает новые горизонты в науке, делая возможным более точное понимание механизмов наследственности, адаптации и болезней.

WGS обладает следующими преимуществами:

• позволяет охарактеризовать мутации по всей последовательности, если есть эталонный геном,
• провести популяционный анализ и филогенетическое исследование,
• изучить ассоциации мутаций с определенными заболеваниями,
• использовать полученные данные в разработке лекарственных препаратов, а также для персонализированной медицины.

Полноэкзомное

Кодирующая часть генома — экзом — составляет всего около 1,7% всей последовательности ДНК. При этом 85% мутаций, вызывающих заболевания, происходят именно в экзоме. Поэтому предоставляет больше достоверных данных при исследовании определенных вариантов наследственных мутаций или изменений, которые можно использовать в селекции для улучшения сельскохозяйственных культур, чем секвенирование всего генома [2].

Для секвенирования экзома в качестве способа выделения целевой ДНК используется таргетное обогащение. Как и в случае с обычным секвенированием, сначала происходит фрагментация выделенной ДНК, а затем создание библиотеки с обязательным таргетным обогащением.

По сравнению с полногеномным секвенированием полноэкзомное секвенирование дешевле и надёжнее, так как глубина прочтения увеличивается из-за меньшей длины общей последовательности. Выходные данные получаются меньше по объёму, поэтому их анализ проходит быстрее и проще. Как и полногеномное секвенирование, полноэкзомное секвенирование используется в медицинских, исследовательских и сельскохозяйственных целях. Для изучения редких менделевских заболеваний секвенирование экзома — наиболее эффективный способ выявления генетических вариантов.

Таргетное секвенирование ДНК

Таргетное секвенирование, в отличие от полногеномного (WGS) и экзомного (WES) секвенирования, помогает расшифровать последовательность определенных генов или мишеней, связанных с патологией. Таким образом, таргетное позволяет определить последовательность с меньшими затратами и при этом с большей глубиной покрытия для анализа конкретных участков генома. Этот вариант секвенирования подразумевает меньшую длину определяемой последовательности, чем полноэкзомное секвенирование. Таргетное отлично подходит для работы с ДНК низкого качества. Именно поэтому этот тип определения последовательности широко используется в диагностике или для разработки терапевтических средств.

Например, таргетное используется для определения мутаций в таких генах, как KRAS и TP53, которые часто становятся одним из факторов развития некоторых видов онкологии [4, 5]. Большая глубина делает таргетное секвенирование очень эффективным для профилирования клинических образцов. Особенно это касается опухолевых образцов, в которых целевая последовательность чаще всего представлена в очень низких концентрациях.

Таргетное обогащение стало возможным после разработки таргетного обогащения, которое чаще всего осуществляется с помощью амплификации целевых фрагментов генома или на основе гибридизации. При этом обогащение с помощью амплификации обходится дешевле, но равномерность покрытия при этом ниже, чем при обогащении на основе гибридизации [6].

Таргетное секвенирование РНК

Таргетное работает и с РНК — при этом исследуются именно целевые последовательности. Этот подход позволяет точно определить, активен ли определенный ген в конкретной ткани в данный момент. Подобный подход обеспечивает высокую точность и экономичность по сравнению с секвенированием всего транскриптома — совокупной последовательности всей РНК клетки или ткани [8]. Метод позволяет определять экспрессию конкретных белков в количестве от десятков до нескольких тысяч.

Данные, полученные с помощью таргетного секвенирования РНК, позволяют получить информацию для анализа дифференциальной экспрессии — обратимых изменений в активности генов, связанных с конкретным состоянием, экспрессии определенных аллелей. Также можно определять наличие генетических патологий и реакцию пациента на терапию. Секвенирование транскриптома рака дает ценную информацию об изменениях в экспрессии генов в опухолях.

Метагеномный и метатранскриптомный анализ

Метагеномика изучает ДНК группы определённых видов, что чаще всего применяется для анализа состава микробных сообществ. Это позволяет изучать поведение сообщества организмов, находящихся в схожих условиях или в одной среде. Чаще всего метагеном анализируют с помощью микрочипов, которые позволяют выявить присутствие конкретных видов в образце. Такой подход можно использовать как в медицинских целях, например для анализа кишечной микрофлоры, так и при изучении микробного состава водоёма или, например, йогурта.

После секвенирования метагенома проводят выравнивание последовательностей для обнаружения фрагментов генома определённых видов. После выравнивания филогенетическое дерево показывает отношения каждого организма в сообществе и детали его поведения.

Метатранскриптомика изучает РНК организма (транскриптом), которые образуются при реализации генетической информации. Анализ транскриптома позволяет выяснить, какие именно гены активны в тех или иных тканях организма. В свою очередь, метатранскриптомика — это анализ нескольких транскриптомов в популяциях или сообществах.

Для такого анализа также чаще всего используются микрочипы. Однако область метатранскриптомики намного сложнее по сравнению с метагеномикой. Извлечь мРНК или РНК в целом не так просто, как кажется. Дело в том, что РНК очень легко разрушается, а ее выделение и хранение требуют определенных условий [10].

Секвенирование метилома

Технологии изменили не только подход исследователей к классической генетике, но и к области эпигенетики. Эпигенетика — раздел генетики, изучающий наследуемые изменения ДНК, которые не затрагивают последовательность нуклеотидов. Эпигенетические метки представляют собой присоединённые к конкретному нуклеотиду функциональные группы, влияющие на активность участка, на котором они расположены. Эпигенетика во многом рассказывает о влиянии окружающей среды и питания организма на его геном. Современные методы позволяют выявлять эпигенетические особенности генома с точностью до одного нуклеотида [11].

Метилирование ДНК — наиболее изученная эпигенетическая метка, участвующая в различных процессах в клетках человека, к которым относятся:

• регуляция генов,
• геномный импринтинг — особенности активности гена в зависимости от того, от какого из родителей он унаследован,
• эмбриональное развитие
• модификация структуры хроматина,
• развитие ряда заболеваний, например, рака [12].

Метилирование ДНК представляет собой ковалентную модификацию цитозиновых нуклеотидов, обычно расположенных в паре нуклеотидов цитозин-гуанин [13]. Химическая реакция проводится группой специальных белков, называемых метилтрансферазами [14].


В качестве экспериментальных методов обнаружения метилирования ДНК используются ферменты рестрикции, способные «разрезать» ДНК в нужных исследователям местах; аффинное обогащение — присоединение специальных молекул к интересующему участку и бисульфитная конверсия — процесс замены цитозина на урацил [15, 16]. Если цитозин превращается в урацил, ученые понимают, что данный нуклеотид не метилирован.

Исследование метилома можно проводить по всему геному или только по интересующему фрагменту последовательности. На данный момент наиболее распространенным методом анализа метилирования является бисульфитная конверсия [17, 18].

Заключение

Развитие методов закономерно приводит к расширению возможностей использования полученных данных. Помимо фундаментальных исследований, для которых чаще всего используется полногеномное секвенирование, в медицине удобно применять полноэкзомное или таргетное секвенирование. В свою очередь, метагеномное или метатранскриптозное секвенирование отлично подходит для исследования микробиома, и в последние годы этот анализ становится все более востребованным.

Полногеномная библиотека с бисульфитной конверсией

Полногеномное секвенирование с использованием бисульфита натрия предоставляет наиболее полные и точные данные о метилировании [16]. Именно поэтому, если необходимо изучить метилирование генома, библиотека для секвенирования подготавливается особым образом — с бисульфитной конверсией.

При подготовке библиотеки неметилированный цитозин в ДНК подвергают модификации с помощью бисульфитной соли [17]. Бисульфит вступает в реакцию с неметилированным цитозином, превращая его в урацил, который при проведении ПЦР амплифицируется в виде тимина. В свою очередь, метилированные цитозины остаются неизменными. Таким образом, можно с высокой точностью отслеживать эпигенетические изменения генома.

Автоматизация создания библиотек

Рабочие станции для выделения нуклеиновых кислот порой могут быть использованы и для подготовки библиотеки. При достаточно масштабной работеих использование значительно сокращает время, сохраняя высокую точность [18]. Например, робот Opentrons OT-2, способен выполнять большинство шагов даже сложных рабочих процессов с минимальным вмешательством сотрудника лаборатории.

Заключение

Подготовка библиотеки, как и другие этапы, требует модификации протокола подготовки образцов в соответствии с конкретной задачей. В зависимости от того, планирует ли исследователь изучить метилирование, отследить определенные мутации или собрать эталонный геном, различаются и методы, реактивы и оборудование.

Тем не менее, мы выяснили, что подготовка библиотеки включает в себя несколько основных этапов: фрагментацию, репарацию концов фрагментов, присоединение адаптеров и проверку качества и концентрации. От того, насколько правильно будет выбран подход к созданию библиотеки и насколько качественным он будет, во многом зависит итоговый результат NGS.

Источники

1. «Секвенирование всего генома», CD Genomics (URL: https://www.cd-genomics.com/)
2. «Секвенирование всего экзома», CD Genomics (URL: https://www.cd-genomics.com/)
3. Шин Й.-Дж. «Панели WES WGS: какой подход NGS лучше?», 3 миллиарда (URL: https://3billion.io/index)
4. Лоххед П. и др. Тестирование микросателлитной нестабильности и мутации BRAF для прогнозирования развития колоректального рака // Журнал Национального института рака. — 2013. — Т. 105. — № 15. — С. 1151-1156.
5. Ходис Э. и др. Обзор драйверных мутаций при меланоме // Cell. – 2012. – Т. 150. – №. 2. – С. 251-263.
6. Самородницкий Е. и др. Оценка методов гибридизационного захвата в сравнении с методами на основе ампликонов для полноэкзомного секвенирования // Мутации человека. — 2015. — Т. 36. — №. 9. — С. 903-914.
7. Бевик-Копли Ф. и др. Применение и анализ целевого геномного секвенирования в исследованиях рака // Журнал вычислительной и структурной биотехнологии. — 2019. — Т. 17. — С. 1348-1359.
8. Мерсер Т. Р. и др. Целенаправленное секвенирование РНК раскрывает сложную структуру транскриптома человека //Nature biotechnology. — 2012. — Т. 30. — №. 1. — С. 99-104.
9. «Обзор ампликонов и метагеномики», Happy Belly Bioinformatics (URL: https://astrobiomike.github.io/)
10. Агиар-Пулидо В. и др. Подходы метагеномики, метатранскриптомики и метаболомики для анализа микробиома: дополнительный выпуск: методы биоинформатики и их применение для обработки больших данных метагеномики // Эволюционная биоинформатика. — 2016. — Т. 12. — С. EBO. S36436.
11. Раулусевичене И., Драблос Ф., Рай М. Б. Данные о метилировании, полученные с помощью секвенирования: экспериментальные подходы и рекомендации по инструментам и алгоритмам анализа данных // Клиническая эпигенетика. — 2019. — Т. 11. — №. 1. — С. 1-13.
12. Йонг В. С., Хсу Ф. М., Чен П. Й. Профилирование метилирования в масштабах всего генома // Эпигенетика и хроматин. — 2016. — Т. 9. — №. 1. — С. 1-16.
13. Дор Й., Седар Х. Принципы метилирования и их значение для биологии и медицины //The Lancet. — 2018. — Т. 392. — №. 10149. — С. 777-786.
14. Лонг М. Д., Смираглиа Д. Дж., Кэмпбелл М. Дж. Геномное влияние метилирования CpG-повторов на экспрессию генов; взаимосвязь при раке простаты // Biomolecules. – 2017. – Т. 7. – №. 1. – С. 15.
15. Баррос-Сильва Д. и др. Профилирование метилирования на основе методов секвенирования нового поколения: новые открытия и клиническое применение // Genes. — 2018. — Т. 9. — №. 9. — С. 429.
16. Бок К. Анализ и интерпретация данных о метилировании //Nature Reviews Genetics. – 2012. – Т. 13. – №. 10. – С. 705-719.
17. Фроммер М. и др. Протокол геномного секвенирования, позволяющий выявить остатки 5-метилцитозина в отдельных цепях // Труды Национальной академии наук. — 1992. — Т. 89. — № 5. — С. 1827-1831.
18. Харрисон А., Парл-МакДермотт А. Метилирование: хронология методов и их применение // Границы генетики. — 2011. — Т. 2. — С. 74.