Top.Mail.Ru
К основному контенту
 
ОСНАЩЕНИЕ И УСЛУГИ ДЛЯ НАУЧНЫХ ЛАБОРАТОРИЙ
Telegram

Особенности и задачи таргетного обогащения

Введение

Секвенирование следующего поколения сделало возможным одновременный скрининг разных образцов, включая материал из клеток человека, на несколько маркеров. Тем самым процесс значительно сократился по времени и стоимости. За счет этого он смог конкурировать с такими распространенными для подобного анализа методами, как ПЦР, секвенирование по Сэнгеру и флуоресцентная гибридизация in situ [1].

В качестве анализа на клинически значимые маркеры довольно часто используется метод целевого секвенирования. Этот подход требует дополнения в виде еще одного этапа пробоподготовки — таргетного обогащения, которое обеспечивает точное и эффективное секвенирование интересующих маркеров [2]. Таргетное обогащение — процесс увеличения количества интересующего исследователя фрагмента кода в тысячи раз. Это нужно, чтобы гарантировать его наличие в полученных после секвенирования данных, что является ключевым для выявления основных генетических изменений [3].

Чаще всего используются два подхода для таргетного обогащения — при помощи амплификации и при помощи гибридизации [4]. В этой статье мы подробнее узнаем об этих и других методах, а также возможностях их автоматизации и приложениях, включая использование технологий Illumina для анализа нуклеотидов и состава генетического материала. Выберите подходящий метод для каждого исследования, чтобы получить максимально точную информацию, особенно в медицинских целях. Современные технологии позволяют проводить анализ даже из пробирке, что делает процесс более доступным и эффективным в день проведения исследования.
Обогащение при помощи амплификации
Как следует из названия, метод таргетного обогащения при помощи амплификации подразумевает использование ПЦР. При этом праймеры предназначены для нацеливания на области, граничащие с теми, которые исследователь хочет определить и проанализировать. Подход позволяет амплифицировать искомые фрагменты ДНК для их последующего секвенирования [5].

Как правило, разрабатывается несколько праймеров, а условия ПЦР стандартизируют для одновременной амплификации всех искомых областей ДНК. Может понадобиться от сотен до тысяч праймеров, которые включены в заранее подготовленный набор, поставляемый поставщиками [6]. Такие наборы удобны из-за своей надежности, но довольно часто исследователям может понадобиться свой собственный набор праймеров.
Схема таргетного обогащения при помощи амплификации

Обогащение при помощи амплификации более всего подходит для работы с ограниченным количеством ДНК, или же при низком качестве полученных образцов. Поэтому этот подход чаще используют при секвенировании образцов опухолей, полученных в малых количествах или обработанных "грубыми" методами, например, фиксированные в формалине.

Метод используется для исследования генома на мутации в генах BRCA1/2, которые с высокой долей вероятности становятся причиной онкологии [7]. В качестве модификаций метода, позволяющих проводить амплификацию сразу в нескольких образцах ДНК, используется параллельная жидкостная доставка смеси. Также она позволяет автоматизировать процесс секвенирования.
Помимо этого была адаптирована другая специализированная технология ПЦР — мультиплексная. Она позволяет уменьшить количество необходимых для проведения процедуры обогащения праймеров [8].

В целом, благодаря своей универсальности, совместимости со сложными образцами и относительно быстрым и простым рабочим процессам, методы на основе ампликонов ПЦР предпочтительны и применяются для обогащения мишеней NGS-секвенирования. Если необходим анализ небольших областей ДНК, особенно в нескольких разных образцах, то используют метод обогащения на основе амплификации. При его использовании подразумевается равномерный охват интересующей области ДНК для последующего секвенирования.
Обогащение при помощи гибридизации

Суть метода — использование специфических для последовательности одноцепочечных олигонуклеотидов, называемых зондами. Прикрепляясь к интересующей последовательности, они тем самым "выделяют" целевую ДНК [9]. Используются как ДНК, так и РНК зонды, однако чаще используют первые из-за их большей стабильности.

Для обогащения при помощи гибридизации выделенную ДНК сперва подвергают фрагментации при помощи ультразвука или ферментативного расщепления. Затем следует классическое присоединение адаптеров и ПЦР амплификация всей геномной ДНК. Полученная библиотека подвергается денатурации и, наконец, гибридизации с зондами, которые присоединяются к интересующим исследователей фрагментам.
Схема таргетного обогащения при помощи гибридизации

Метод обогащения при помощи гибридизации бывает двух типов: с использованием захвата "твердой фазы" (зонды иммобилизуют на твердой поверхности), и с использованием "захвата раствора" (зонды и библиотека взаимодействуют в растворе) [10, 11]. Второй подход более простой и надежный, поэтому сейчас чаще всего используют именно его.

Захват "твердой фазы" подразумевает связывание фрагментов с зондами на специальных гранулах, после чего остальная часть библиотеки удаляется и секвенирование проводится уже только для оставшейся, интересующей части иммобилизованных фрагментов (правда перед этим ее еще раз подвергают амплификации).

Важную роль играет размер фрагментов ДНК, полученный на первом этапе подготовки библиотеки. Более короткие фрагменты обеспечивают высокий уровень специфичности при связывании с зондами, в то время как длинные фрагменты могут способствовать связыванию не тех фрагментов кода. Тем не менее, не стоит забывать, что более длинные фрагменты дают более точный итоговый вариант последовательности после этапов биоинформатической обработки данных.

Длительность процесса зависит от сложности и размера интересующей последовательности генома, типа исходного образца, количества и качества ДНК после выделения. Тем самым, гибридизация занимает от 2 до 48 часов. Время на нее должно быть рассчитано заранее [12].

Для анализа длинных фрагментов, например, всего экзома, используется обогащение методов гибридизации, которое работает с большими целевыми областями.
Обогащение с использованием зондов молекулярной инверсии (MIP)

Такой подход к обогащению используют в первую очередь для поиска однонуклеотидных мутаций (SNP). Для обнаружения целевой последовательности синтезируются одноцепочечные олигонуклеотиды со специфичными для мишени зондами. Отжиг олигонуклеотидов на целевой последовательности исходной ДНК предшествует проведению ПЦР. К одному концу зонда присоединен биотинин для последующего захвата исследуемых последовательностей магнитными шариками. Данный метод используется при работе с небольшим количеством мишеней, иначе он может ошибочно связываться с неспецифическими последовательностями [13].
Обогащение при помощи удлинения праймера (PETE)

Данный подход к обогащению схож с предыдущим, с той разницей, что в нем используются биотинилированные праймеры вместо зондов. Праймеры задействованы при захвате и обогащении целевой последовательности, но не при амплификации. После гибридизации фрагменты присоединяются к магнитным шарикам. Данный метод имеет высокую специфичность [14].
Проблемы и перспективы таргетного обогащения


Главная задача таргетного обогащения — сделать секвенирование отдельных участков максимально доступным. Оно повышает надежность секвенирования при работе с целевыми участками, гарантируя результат.

Одно из слабых мест таргетного обогащения — неравномерность покрытия. Оно существенно снижает доверие к методу при использовании его для диагностики заболеваний [15]. Тем не менее, целевое обогащение в сочетании с NGS открывает новые возможности в таких областях, как микробное тестирование и диагностика генетических патологий [16]. Обнаружение генетических вариантов у онкобольных —важный фактор для принятия решения о применении тех или иных дорогостоящих препаратов. Также таргетное обогащение позволяет исследователям сосредоточится на интересующей их области генома, так как секвенирование в итоге проводится только для целевой последовательности.

Еще одним значимым достижением таргетного обогащения стала возможность создания индивидуальных панелей под пациентов. Это позволяет наиболее эффективно применять сложные диагностические методы, такие, как секвенирование. Таргетное обогащение позволяет работать с целевой ДНК. Однако, развитие методов секвенирование может привести к тому, что обогащение не понадобится для "выделения" исследуемых фрагментов. Поэтому, метод неминуемо ждут дальнейшие модификации, которые позволят ему оставаться востребованным и эффективным.
Заключение

Таргетное обогащение — необходимое дополнение к протоколу секвенирования. Особенно, если исследователи заинтересованы в изучении конкретных, относительно небольших фрагментах кода. Современные модификации метода позволяют автоматизировать процесс и проводить параллельный анализ разных заболеваний.
Источники

  1. Zhang J. et al. The impact of next-generation sequencing on genomics //Journal of genetics and genomics. – 2011. – Т. 38. – №. 3. – С. 95-109.

  2. Lefterova M. I. et al. Next-generation sequencing for infectious disease diagnosis and management: a report of the Association for Molecular Pathology //The Journal of Molecular Diagnostics. – 2015. – Т. 17. – №. 6. – С. 623-634.

  3. Grover C. E., Salmon A., Wendel J. F. Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis1 //American journal of botany. – 2012. – Т. 99. – №. 2. – С. 312-319.

  4. Mertes F. et al. Targeted enrichment of genomic DNA regions for next-generation sequencing //Briefings in functional genomics. – 2011. – Т. 10. – №. 6. – С. 374-386.

  5. Singh R. R. Target enrichment approaches for next-generation sequencing applications in oncology //Diagnostics. – 2022. – Т. 12. – №. 7. – С. 1539.

  6. Singh R. R. et al. Clinical validation of a next-generation sequencing screen for mutational hotspots in 46 cancer-related genes //The Journal of molecular diagnostics. – 2013. – Т. 15. – №. 5. – С. 607-622.

  7. Ozcelik H. et al. Long-range PCR and next-generation sequencing of BRCA1 and BRCA2 in breast cancer //The Journal of Molecular Diagnostics. – 2012. – Т. 14. – №. 5. – С. 467-475.

  8. Zheng Z. et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing //Nature medicine. – 2014. – Т. 20. – №. 12. – С. 1479-1484.

  9. Lesnik E. A., Freier S. M. Relative thermodynamic stability of DNA, RNA, and DNA: RNA hybrid duplexes: relationship with base composition and structure //Biochemistry. – 1995. – Т. 34. – №. 34. – С. 10807-10815.

  10. Okou D. T. et al. Microarray-based genomic selection for high-throughput resequencing //Nature methods. – 2007. – Т. 4. – №. 11. – С. 907-909.

  11. Gnirke A. et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing //Nature biotechnology. – 2009. – Т. 27. – №. 2. – С. 182-189.

  12. Clark T. A. et al. Analytical validation of a hybrid capture–based next-generation sequencing clinical assay for genomic profiling of cell-free circulating tumor DNA //The Journal of Molecular Diagnostics. – 2018. – Т. 20. – №. 5. – С. 686-702.

  13. Gnirke A. et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing //Nature biotechnology. – 2009. – Т. 27. – №. 2. – С. 182-189.

  14. "What is NGS Target Enrichment and why is it important?", Roshe (URL: https://sequencing.roche.com/global/en/home.html)

  15. Harismendy O. et al. Evaluation of next generation sequencing platforms for population targeted sequencing studies //Genome biology. – 2009. – Т. 10. – №. 3. – С. 1-13.

  16. Dahl A. et al. The application of massively parallel sequencing technologies in diagnostics //F1000 biology reports. – 2010. – Т. 2.