Особенности выделения ДНК из разных типов образцов

Введение

Одна из основных причин увеличения темпов развития медицины — появление возможности секвенировать последовательность ДНК и добраться до истоков возникновения патологии. Стремительный прогресс в отрасли приводит к появлению новых методов анализа, работы с образцами и подходов к определению последовательности. Это может быть секвенирование нового поколения, или просто NGS, или "золотой" стандарт — секвенирование по Сэнгеру. Для каждого из подходов характерны свои особенности: это могут быть модификации в подготовке библиотеки, таргетное обогащение или определенные пайплайны биоинформатического анализа. Однако не стоит забывать, что успех всего процесса работы с нуклеиновыми кислотами во многом зависит от того, насколько много и какого качества удастся выделить ДНК или РНК из исходного образца.

Выделение ДНК или РНК может быть самым простым и рутинным этапом работы для сотрудника лаборатории, если он пользуется одной проверенной сто раз методикой. Или же сотруднику придется в прямом смысле импровизировать и комбинировать разные подходы. Фрагмент кости неандертальца, ткань растения с обилием эфирных масел в своем составе, неуловимые вирусные частицы или образец воздуха в школьной столовой — каждый объект уникален. К каждому из них нужен свой подход, оттого порой и встречаются трудности на самом первом лабораторном этапе работы с полученными образцами — экстракции ДНК. А ведь впереди еще секвенирование! Давайте разберемся, откуда можно извлечь ДНК, зачем и, самое главное, как?
Основные принципы выделения нуклеиновых кислот

Внутри клеток любого из организмов на планете есть носитель наследственной информации — ДНК или РНК. ДНК — сложная молекула с необходимой информацией для построения и поддержания жизни. Экстракция ДНК — один из самых важных методов генетического исследования, позволяющий добиться огромных успехов в лабораториях молекулярной биологии, биотехнологии и биоинформатики [1].

Каким бы ни был объект, из которого необходимо выделить ДНК — растительная или животная клетка, вирус, бактерия, окаменевшая или мумифицированная ткань, — общими для всех источников нуклеиновых кислот будут три этапа выделения [2]:

  1. Лизис — нарушение цитоплазматических и ядерных мембран.

  2. Очистка ДНК от других компонентов клеточного лизата, таких, как липиды, белки и другие нуклеиновые кислоты. ДНК отделяется от лизата двумя основными методами — при помощи химического агента (например, фенол-хлороформа, который связывает белки, что позволяет отделить их от нуклеиновых кислот), или при помощи твердых материалов — фильтровальной бумаги, мембран из силиката, магнитных шариков, полимерных смол или наноматериалов.

  3. Элюирование — отделение ДНК от других веществ и последующее ее концентрирование. Для этого используют увеличение pH примерно до 8 [3].

Некоторые производители предусмотрели специфику выделения в зависимости от объектов. Так, наборы для выделения Raissol представляют собой широкий спектр решений для выделения ДНК в зависимости от задач.
Выделение нуклеиновых кислот из тканей животных и человека

Генетический анализ стал неотъемлемой частью многих медицинских процедур, от диагностики заболевания до индивидуального подбора наиболее эффективной терапии. Такое стремительное развитие отрасли привело к закономерному увеличению возможных подходов к работе с генетическими данными. Но сперва, чтобы их получить, необходимо выделить ДНК.

Получать ДНК животных и человека можно из разных типов тканей, каждая из которых имеет свои особенности. Так, можно экстрагировать нуклеиновые кислоты из:

  • сыворотки крови;

  • плазмы крови методом сорбции на магнитных частицах в специально разработанном буфере, который способствует связыванию коротких фрагментов ДНК на силикатной матрице и препятствует связыванию с ней белков;

  • цельной крови. Кровь — распространенный источником ДНК. Обычно ее обрабатывают с помощью центрифугирования для отделения эритроцитов от лейкоцитов. Затем белые кровяные клетки лизируют с помощью реагентов, содержащих ферменты. Они денатурируют белки и высвобождают геномную ДНК. Полученное вещество может подвергаться дальнейшим этапам очистки в зависимости от области применения. Из цельной крови ДНК экстрагируется методом сорбции на магнитных частицах. При этом используют буфер для удаления красных клеток крови, чтобы получить высокие концентрации ДНК. Фактические протоколы экстракции значительно различаются в зависимости от целей пробоподготовки. Например, для выделения геномной ДНК лейкоциты необходимо отделить от остальных компонентов [4]. Напротив, для обнаружения патогенных нуклеиновых кислот или бесклеточных ДНК, перед экстракцией отделяют либо сыворотку, либо зараженные патогеном клетки крови [5]. Удаление эритроцитов также помогает уменьшить уровень гемоглобина, одного из основных источников ингибиторов последующих этапов работы. Далее могут следовать анализ коротких тандемных повторов, обнаружение однонуклеотидного полиморфизма, судебно-медицинская экспертиза, диагностика рака или наследственной патологии.;

  • клеточных сред, тканей. Такие ткани, как печень, мозг, мышцы и кожа, содержат различное количество ДНК, которую можно выделить с помощью различных протоколов. Например, ткани с высоким содержанием жира (например, мозг и жировая ткань), могут потребовать дополнительного механического разрушения и экстракции хлороформом для удаления липидов. Ткани также можно разрушить с помощью гомогенизатора или ступки и пестика, а затем подвергнуть ферментативному перевариванию для высвобождения ДНК. Из тканей ДНК экстрагируется методом сорбции на магнитных частицах. Для этого используется оптимизированный буфер, позволяющий работать с образцами, хранящимися в спирту;

  • буккальных мазков, цервикальных мазков, слюны, мокроты. Для этого используется метод сорбции на кремниевой мембране спин-колонок;

  • кала. Выделение проводится с использованием магнитных частиц, позволяющих экстрагировать ДНК как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий;

  • амниотической жидкости. Проводится путем тотального спиртового осаждения. Так как количество клеток, содержащих ДНК плода в амниотической жидкости, крайне мало, в метод внесены модификации, способные увеличить выход качественной ДНК для последующего анализа.

  • спинномозговой жидкости;

  • мочи.

Неизменной популярностью пользуется использование ffpe-блоков (фиксированные формалином животные (и человеческие) ткани заливают парафином и хранят десятилетиями) для хранения тканей и последующей экстракции, например, на магнитных частицах. Стоит отметить, что экстракция ДНК хорошего качества стала доступна относительно недавно. Это произошло после оптимизации протоколов очистки нуклеиновых кислот от молекул формалина. Молекулярный анализ тканей из ffpe-блоков может предоставить новые сведения для обнаружения биомаркеров многих патологий, например, рака.

Для выделения ДНК из ffpe-блоков необходимо провести:

  • депарафинизацию — удалить парафин. Для этого используются растворители, например, ксилол, или нетоксичные вещества на масляной основе в сочетании с подогревом.

  • отделение ДНК от других компонентов раствора.

  • удаление белков, связывающихся с молекулами ДНК при фиксации парафином. Для этого обазцы инкубируют в термостате.

  • собственно экстракцию, например, при помощи мембраны из силиката или магнитных шариков [6].

Помимо очевидной необходимости в выделении ДНК человека для диагностики патологий и поиска путей для борьбы с ними, есть множество других целей для генетического анализа ДНК разных организмов, населяющих нашу планету.

Например, необходимо найти способы остановить сокращение численности опылителей, в частности, пчел, так как это может привести к продовольственной катастрофе. Активно изучается механизм действия пестицидов на насекомых. Обнаружено, что воздействие токсичных для них веществ вызывает мутации в геноме и приводит к изменению важных генов, принимающих участие в регуляции питания, иммунитета и социального взаимодействия [7]. Другая важная задача, стоящая перед учеными — изучение ДНК организмов, проживающих на планете на сотни лет дольше нас.
Выделение нуклеиновых кислот из костей и окаменевших останков

Первую древнюю ДНК выделили в 1984 году из останков мышцы квагги (вымершей зебры), которые хранились в музее [8]. Полученная нуклеиновая кислота была размером всего 229 п.н.. Спустя около тридцати лет, исследователи начали выделять ДНК из образцов возрастом до 780000 лет [9]. Удалось полностью секвенировать геном шерстистого мамонта, пещерного медведя и неандертальцев [10,11]. Активно изучаются образцы древних геномов людей, животных, растений и микробных сообществ.

Но зачем же изучать ДНК, которая не только довольно сильно деградировала со временем, но и порой принадлежит тем, кого на планете уже нет? Причин несколько:

  • Благодаря генетическим данным видов, проживающих в ту или иную эпоху, можно достаточно достоверно определить условия окружающей среды, характерные для определенного периода.

  • Возможность изучения новых видов: например, ученые смогли открыть новые ветви в генеалогическом древе человека, добавив туда денисовцев. Также, удалось прояснить историю одомашнивания животных и перехода от собирательства к сельскому хозяйству.

  • Исследование происхождения болезней: древняя ДНК помогла выяснить откуда произошли многие инфекционные заболевания, а также как они распространялись.

  • Восстанавливать генеалогического древа жизни на планете.

Все современные достижения в области изучения древней ДНК стали возможны благодаря совершенствованию методики секвенирования и выделения нуклеиновых кислот. Успех NGS в этой области — возможность проводить секвенирование и анализ миллионов локусов ультракоротких фрагментов ДНК параллельно.

ДНК можно выделять из зубного камня, древесины, раковины моллюсков, пергамента, тканей, костей. Часто, к моменту попадания в лабораторию, исходные образцы сильно разрушены и загрязнены другими источниками ДНК: не только древними (например, бактериями, которые разлагали мясо на костях мамонта), но и современными источниками нуклеиновых кислот (привет бактериям-современникам и сотрудникам лаборатории). Поэтому особое внимание при работе с древней ДНК уделяется этапам ее очистки и концентрирования.

Чтобы максимально сохранить целостность останков и сделать возможным дальнейший анализ, ученые разработали отдельные методики для взятия разных типов образцов, например, костей или растительных остатков. Прийти к положительному итоговому результату помогает оптимизация процесса на каждом из этапов. Для древней ДНК характерно небольшое ее количество и высокая степень фрагментации (некоторые "кусочки" ДНК насчитывают менее 100 п.н. (иногда всего 35 !))[12]. При работе с такими короткими фрагментами возникают сложности на этапе отделения их от фрагментов ДНК других видов и малых молекул, загрязняющих образец и способных сорвать всю последующую процедуру анализа (ПЦР, секвенирование).

Еще одна особенность протоколов выделения ДНК из древних образцов — помимо ДНК можно сразу извлекать белки для радиоуглеродного или протеомного анализа. Так как материала для работы изначально мало, то приходится хитрить и объединять методики.

В большинстве случаев образцы сперва механически измельчают до порошка, а затем инкубируют в буферном растворе для высвобождения ДНК. Буфер представляет собой раствор, способствующий разрушению солей кальция, расщеплению белков и липидов. Его применение приводит к отделению нуклеиновых кислот от других молекул. Иногда добавляют еще одну стадию для удаления слабо связанных загрязнителей — обработку отбеливателем для ликвидации ингибиторов, либо же поэтапное разложение и удаление экстрагированной фракции (самой загрязненной) [13,14]. Однако, следует помнить, что ДНК изначально в образце довольно немного, а некоторые этапы очистки способствуют уменьшению количества необходимого материала.

Методы, наиболее часто используемые для выделения древней ДНК, основаны на адсорбции молекул нуклеиновых кислот частицами кремнезема в буфере с хаотропными солями — на спин-колонках — или на магнитных шариках, покрытых кремнеземом [15]. После их использования и промывки ДНК этанолом, ее элюируют буфером с низким содержанием солей. Иногда в работу добавляют стадию очистки фенол-хлороформом.

Экстракты ДНК из древнего материала, как правило, представляют собой метагеномные комплексы, которые включают в себя ДНК хозяина и связанных с ним микроорганизмов, а также ряда микроорганизмов из окружающей среды, которые колонизируют образец после его смерти [16].

Данные, полученные после экстракции ДНК из древних образцов имеют также и историческую ценность. Например, недавно ученые проанализировали ДНК, выделенную из волос знаменитого композитора Людвига ван Бетховена и обнаружили, что он, вероятно, был болен гепатитом B, что и стало причиной смерти [17].
Выделение нуклеиновых кислот из бактерий и вирусов

Появление новых инфекционных штаммов и преодоление межвидового барьера открывают пути для появления новых инфекционных заболеваний. Сотрудникам лабораторий то и дело приходится вновь оптимизировать протоколы под новый объект. Выделять ДНК бактерий и вирусов можно из тканей зараженного человека, животного, растения, бактерии. Это затрудняет процесс работы за счет присутствия ДНК другого вида (еще и в большом количестве).

Выделяют нуклеиновые кислоты путем щелочного лизиса для отделения ДНК микробов от молекул хозяина при помощи спин-колонок. Выделять НК можно также из микробов почвы, воздуха, водоемов. Для этой процедуры используют сорбция ДНК на магнитных шариках.
Выделение нуклеиновых кислот из растений

Для растений и микробов применяют специфические протоколы выделения ДНК. Растительные ткани содержат клеточные стенки и вторичные метаболиты, которые могут препятствовать этому процессу.

Выделение нуклеиновых кислот из растительной ткани может стать настоящим вызовом творческому потенциалу сотрудника лаборатории. Виной тому ингибирующие вещества — полисахариды, полифенолы, ДНКазы. Самое интересное, что от вида к виду их свойства и количество меняются, что вынуждает регулярно подгонять методику под конкретный объект. К тому же клеточная стенка растений отличается от животной.

При работе с тканями растений исследователи предпочитают выделять ДНК из молодых растений — как правило они содержат меньше вторичных метаболитов. Однако извлечение ДНК из гербария или мумифицированной ткани тоже распространено. Наиболее частый объект выделения — листья.

Анализ данных, полученных после работы с экстрагированной из растительных тканей ДНК, позволяет определить функции отдельных генов, играющих важную роль в жизни растения. Также исследования направлены на изучение эволюции и адаптационных особенностей растений для селекции полезных для человека видов с их характерными особенностями.

Как и в работе с другими объектами, экстракция ДНК из растений включает в себя несколько основных этапов: разрушение клеточной стенки и мембраны (лизис), отделение ДНК от других клеточных компонентов и последующую элюцию. Наиболее используемым и универсальным считается выделение с использованием CTAB-буфера. Он хорошо справляется с высоким содержанием полисахаридов и полифенолов в растительных тканях. Микробные клетки, с другой стороны, малы и требуют эффективного лизиса клеток с применением детергентов или ферментативной обработки перед выделением ДНК.
Выделение нуклеиновых кислот при помощи спин-колонок

Впервые силикат при работе с ДНК использовали Б. Фогельштейн и Д. Гиллеспи в 1979 году [18]. Они выяснили, что нуклеиновые кислоты связываются с кремнеземом в растворе NaCl. Таким образом, они отделили ДНК от других компонентов клетки. Это был первый шаг к появлению метода для экстракции, широко используемого в лабораториях по всему миру — с использованием спин-колонок.

Спин-колонка позволяет применять метод твердофазной экстракции — для связывания определенных молекул используется твердый материал, он пропускает через себя одни вещества и задерживает другие. Сперва, как и во многих других подходах к выделению нуклеиновых кислот, необходимо обработать образцы буфером для лизиса. Он разрушает мембраны, позволяя молекулам оказаться за пределами клеточной оболочки. Среди прочих реагентов при экстракции используется протеиназа K, она расщепляет белки; и ЭДТА — он ингибирует ДНКазы. Помимо химического лизиса на образцы воздействуют температурой. Лизис может протекать в термостате, чаще всего при температуре около 50-55 градусов по Цельсию. Более высокая температура может привести к разрушению молекулы ДНК.

Далее следует центрифугирование для удаления буфера и молекул, которые для анализа не понадобятся. После добавляют буфер для связывания, содержащий хаотропные соли (помогут ДНК связаться с силикатом) и этанол. Полученный раствор переносится в спин-колонку — пробирку с размещенной в ней мембраной из силиката. Затем снова следует центрифугирование — после прохождения через мембрану молекулы нуклеиновых кислот свяжутся с силикатом, а остальные компоненты осядут на дно и будут удалены из пробирки. Можно прибегнуть к дополнительной промывке образца буфером для связывания для удаления с мембраны лишних веществ.

Последний этап — элюция — вымывание молекул ДНК. Для этого используют буфер с как правило более высоким pH, чтобы ДНК могла отделиться от мембраны [19].

Спин-колонки позволяют на выходе получать ДНК высокого качества. Также этот метод достаточно экономичен и не занимает много времени.
Схема выделения ДНК в спин-колонке
Схема выделения ДНК в спин-колонке
Выделение нуклеиновых кислот при помощи магнитных частиц

Относительно "молодой" метод выделения — экстракция молекул при помощи магнитных частиц (шариков). Он отлично подходит для выделения как нуклеиновых кислот, так и белков.

После лизиса клетки к образцу добавляют магнитные микрогранулы, или магнитные шарики, на поверхность которых нанесен силикат. Связывание молекул с силикатной поверхностью шариков протекает по тому же принципу, что и с матрицей спин-колонок, в присутствии хаотропных солей (гуанидиний или тиоцианат). Внешний магнит создает магнитное поле, которое приводит к тому, что магнитные шарики с ДНК на поверхности отделяются от клеточного лизата. Пока магнитные шарики удерживаются магнитом, ненужные компоненты образца удаляют. Затем следуют этапы промывки и элюции. Для последнего требуется инкубация при 65 ° C для отделения ДНК от силиката.

Использованные магнитные шарики могут быть вновь задействованы в процессе экстракции. Этот метод масштабируется, что делает его крайне удобным для использования в крупномасштабных процессах экстракции [20]. При этом отсутствует необходимость в центрифугировании. Нуклеиновые кислоты, получаемые при использовании такого метода, отличаются высоким качеством и концентрацией [21].
Схема выделения ДНК с использованием магнитных частиц
Схема выделения ДНК с использованием магнитных частиц
Заключение

Качество выделенной ДНК часто определяет точность и надежность следующих за ее экстракцией методов, таких как ПЦР, секвенирование, клонирование и анализ экспрессии генов.

Экстракция ДНК включает в себя ряд этапов, направленных на выделение высококачественной геномной ДНК из различных типов органических образцов. Это физическое разрушение клеток или тканей и последующая химическая обработка для высвобождения и очистки молекул ДНК.

Еще одна критическая особенность выделения ДНК — использование соответствующих реагентов и ферментов. Для различных методов требуются специфические буферы, детергенты и протеазы, которые эффективно лизируют клетки и денатурируют белки.

Качество выделенной ДНК зависит от нескольких факторов: источник образца, эффективность метода выделения и наличие ингибиторов. Загрязнение другими биологическими веществами, такими как белки, полисахариды и гуминовые кислоты, может повлиять на качество последующих этапов работы с ДНК, например ПЦР и секвенирования. Поэтому, прежде чем приступать к последующей работе, очень важно оценить качество и концентрацию ДНК с помощью спектрофотометрии или гель-электрофореза.

Следует отметить, что выделение ДНК является важным этапом генетического анализа, исследований в области молекулярной биологии и биотехнологии, и диагностики. Выбор метода, оборудования и реагентов зависит от типа образца и качества, и необходимости его последующего анализа. Оптимизация процесса выделения ДНК приводит к получению высококачественной ДНК, способной давать точные результаты.

Прогресс в секвенировании закономерно упростил и ускорил процесса выделения нуклеиновых кислот для разных типов тканей. Все возможные варианты оптимизации направлены на увеличение концентрации ДНК надлежащего качества. Именно от этих параметров ДНК будет зависеть успех дальнейших этапов работы, особенно секвенирования.

Выделение нуклеиновых кислот — это самый первый этап работы с материалом в лаборатории, впереди еще много непростых методов, каждый из которых имеет множество особенностей. Познакомимся с ними в следующих статьях.
Источники

  1. Ghaheri M. et al. A comparative evaluation of four DNA extraction protocols from whole blood sample// Cellular and Molecular Biology. – 2016. – Т. 62. 3. – С. 120-124.

  2. Ali N. et al. Current nucleic acid extraction methods and their implications to point-of-care diagnostics// BioMed research international. – 2017. – Т. 2017.

  3. Paul R., Ostermann E., Wei Q. Advances in point-of-care nucleic acid extraction technologies for rapid diagnosis of human and plant diseases// Biosensors and Bioelectronics. – 2020. – Т. 169. – С. 112592.

  4. Choi J. R. et al. based sample-to-answer molecular diagnostic platform for point-of-care diagnostics// Biosensors and Bioelectronics. – 2015. – Т. 74. – С. 427-439.

  5. Zhang J. et al. A point of care platform based on microfluidic chip for nucleic acid extraction in less than 1 minute// Biomicrofluidics. – 2019. – Т. 13. 3. – С. 034102.

  6. "Learn about DNA extraction from FFPE tissue in 10 minutes" BioChain (URL: https:// www.biochain.com ), дата доступа 12.05.2023

  7. Schmehl D. R. et al. Genomic analysis of the interaction between pesticide exposure and nutrition in honey bees (Apis mellifera)// Journal of insect physiology. – 2014. – Т. 71. – С. 177-190.

  8. Higuchi R. et al. DNA sequences from the quagga, an extinct member of the horse family// Nature. – 1984. – Т. 312. 5991. – С. 282-284.

  9. Orlando L. et al. Recalibrating Equus evolution using the genome sequence of an early Middle Pleistocene horse// Nature. – 2013. – Т. 499. 7456. – С. 74-78.

  10. Palkopoulou E. et al. Complete genomes reveal signatures of demographic and genetic declines in the woolly mammoth// Current Biology. – 2015. – Т. 25. 10. – С. 1395-1400.

  11. Barlow A. et al. Partial genomic survival of cave bears in living brown bears// Nature ecology & amp; amp; amp; evolution. – 2018. – Т. 2. 10. – С. 1563-1570.

  12. Dabney J., Meyer M., Pääbo S. Ancient DNA damage// Cold Spring Harbor perspectives in biology. – 2013. – Т. 5. 7. – С. a012567.

  13. Korlević P. et al. Reducing microbial and human contamination in DNA extractions from ancient bones and teeth// Biotechniques. – 2015. – Т. 59. 2. – С. 87-93.

  14. Gamba C. et al. Comparing the performance of three ancient DNA extraction methods for high ‐ throughput sequencing// Molecular Ecology Resources. – 2016. – Т. 16. 2. – С. 459-469.

  15. Rohland N. et al. Extraction of highly degraded DNA from ancient bones, teeth and sediments for high-throughput sequencing// Nature protocols. – 2018. – Т. 13. 11. – С. 2447-2461.

  16. Orlando L., Gilbert M. T. P., Willerslev E. Reconstructing ancient genomes and epigenomes// Nature Reviews Genetics. – 2015. – Т. 16. 7. – С. 395-408.

  17. Begg T. J. A. et al. Genomic analyses of hair from Ludwig van Beethoven// Current Biology. – 2023.

  18. Vogelstein B., Gillespie D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose// Proceedings of the National Academy of Sciences. – 1979. – Т. 76. 2. – С. 615-619.

  19. Martinez L. M., "Spin Column", Sepmag (URL: https:// www.sepmag.eu )

  20. Martinez L. M., "Magnetic beads DNA", Sepmag (URL: https:// www.sepmag.eu )

  21. Стоянова Э. Е., "Выделяем нуклеиновые кислоты: эволюция методов", Биомолекула (URL: https:// biomolecula.ru )