Ошибки в ПЦР и их причины:
как повысить воспроизводимость результатов

Качество матрицы как ключевой фактор ПЦР

Полимеразная цепная реакция напрямую зависит от качества исходной ДНК или РНК. Деградированная матрица, фрагментация и низкая концентрация приводят к слабому сигналу или отсутствию амплификации. Особенно часто это проявляется при работе с клиническими образцами, кровью, тканями и FFPE материалом. Использование неподходящих наборов для экстракции нуклеиновых кислот приводит к накоплению ингибиторов и снижению активности ферментов.
Наборы Raissol для выделения ДНК ориентированы на получение матрицы, совместимой с ПЦР и qPCR без дополнительных этапов очистки. Это снижает вариабельность результатов и упрощает настройку реакции.

Ингибиторы ПЦР и их влияние на амплификацию

Ингибиторы ПЦР являются одной из наиболее частых причин неудачных реакций. К ним относятся гемоглобин, соли, остаточные белки и компоненты лизирующих буферов. Даже при наличии достаточного количества ДНК ингибиторы могут полностью блокировать активность ДНК полимеразы.
Использование реагентов Raissol с высокой степенью очистки позволяет минимизировать попадание ингибиторов в реакцию. При работе со сложными образцами рекомендуется пересматривать этап экстракции, а не только условия ПЦР.

Выбор ДНК полимеразы и его значение

Неправильный выбор фермента часто приводит к нестабильной амплификации. Стандартные Taq полимеразы подходят для рутинных задач, но при низкой концентрации матрицы или наличии ингибиторов их эффективность резко снижается.
Ферменты Raissol для ПЦР разработаны с учетом клинических и научных задач и демонстрируют устойчивость к ингибирующим факторам. Для повышения специфичности реакции используются hot start полимеразы, которые снижают фоновую активность и образование побочных продуктов.

Неспецифическая амплификация и праймер димеры

Появление неспецифических полос и праймер димеров связано с некорректной температурой отжига, избытком праймеров и активностью фермента при комнатной температуре. Использование hot start решений и оптимизация концентраций позволяют существенно повысить специфичность реакции.
Применение проверенных реагентов одного производителя снижает вариабельность и упрощает оптимизацию условий ПЦР.

Контаминация ампликоном и организация лаборатории

Контаминация ампликоном приводит к ложноположительным результатам и является критической проблемой для диагностических лабораторий. Основными причинами являются перенос аэрозолей, использование одних и тех же зон для постановки реакции и анализа продуктов, а также недостаточная очистка рабочих поверхностей.
Использование фильтр наконечников, разделение зон и стабильные реагенты Raissol позволяют снизить риск контаминации и повысить надежность результатов.