Набор для приготовления библиотек из ампликонов «SG GM Ampli»

Скачать краткую инструкцию "SG GM Ampli" (pdf)

Скачать полную инструкцию "SG GM Ampli" (pdf)

Проведение процедуры приготовления библиотек

Репарация

1. Внести 10 мкл очищенных фрагментов ДНК с концентрацией от 1 до 10 нг/мкл в пробирки в стрипах, либо в 96-луночный планшет объемом 0,2 мл. Концентрация для ампликонов должна быть установлена спектрофотометрически с применением интеркаляторов (#spectrahs-100/500/1000; #spectrabr-100/500/1000).

2. Приготовить мастер-микс на необходимое количество реакций:

3. Перемешать мастер-микс, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.

4. Внести 15 мкл мастер-микса к образцам.

5. Поместить пробирки в амплификатор с предварительно установленной программой для репарации после выхода прибора в рабочее состояние 1-го этапа:

6. После установки пробирок в амплификатор необходимо пропустить первый этап.

Лигирование

1. Приготовить мастер-микс на необходимое количество реакций:

2. Перемешать мастер-микс, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.

3. После завершения программы репарации, внести 25 мкл мастер-микса к образцам.

4. Установить программу для лигирования. Поместить пробирки в амплификатор с предварительно установленной программой для лигирования после выхода прибора в рабочее состояние 1-го этапа:

5. После установки пробирок в амплификатор необходимо пропустить первый этап.

Очистка после лигирования

1. К образцам, содержащим фрагменты <150 п.н., добавить 60 мкл магнитных частиц, к образцам, содержащим фрагменты >150 п.н., добавить 50 мкл магнитных частиц, интенсивно перемешать на вортексе до гомогенного состояния, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.

2. Поместить образцы на магнитный штатив, инкубировать в течение 3-5 минут до прозрачности раствора.

3. Аккуратно, не задевая частицы, удалить супернатант.

4. Добавить 180 мкл 80% этанола к каждому образцу, инкубировать в течение 30 секунд, перемещая пробирки на магнитном штативе, меняя их положение относительно магнита. Аккуратно, не задевая частицы, удалить супернатант.

5. Повторить пункт 4. Высушить образцы с открытыми крышками при комнатной температуре в течение 10 минут или при +37°С до полного испарения спирта.

6. Добавить 24 мкл деионизированной воды к магнитным частицам. Интенсивно перемешать пробирки на вортексе, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.

7. Поместить образцы на магнитный штатив, инкубировать в течение 2-3 минут до прозрачности раствора.

8. Перенести 22 мкл элюата в новые пробирки, не захватывая магнитные частицы.

Постановка индексной ПЦР

1. Добавить к каждому образцу по 2 мкл индивидуального праймерного микса из планшета с праймерами (#Plate1_SG_GM/#Plate2_SG_GM).

2. Приготовить мастер-микс на необходимое количество реакций:

3. Перемешать мастер-микс, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.

4. Внести по 26,25 мкл мастер-микса к образцам.

5. Поместить пробирки в амплификатор. Запустить программу для индексной ПЦР:

Очистка после индексной ПЦР

1. К образцам, содержащим фрагменты <150 п.н., добавить 60 мкл магнитных частиц, к образцам, содержащим фрагменты >150 п.н., добавить 50 мкл магнитных частиц, интенсивно перемешать на вортексе до гомогенного состояния, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.

2. Поместить образцы на магнитный штатив, инкубировать в течение 3-5 минут до прозрачности раствора.

3. Аккуратно, не задевая частицы, удалить супернатант.

4. Добавить 180 мкл 80% этанола к каждому образцу, инкубировать в течение 30 секунд, перемещая пробирки на магнитном штативе. Аккуратно, не задевая частицы, удалить супернатант.

5. Повторить пункт 4. Высушить образцы с открытыми крышками при комнатной температуре в течение 10 минут или при +37°С до полного испарения спирта.

6. Добавить 22 мкл TE буфера с низким содержанием ЭДТА к осадку частиц. Интенсивно перемешать пробирки на вортексе, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.

7. Поместить образцы на магнитный штатив, инкубировать в течение 2-3 минут до прозрачности раствора.

8. Перенести 20 мкл элюата в новые пробирки. Полученные ДНК библиотеки могут храниться при +4℃ в течение суток или при -20℃ более длительный срок. ДНК библиотеки могут быть использованы в дальнейшей подготовке к секвенированию.

вернуться в каталог товаров

1. Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5-2 мл;
2. Штатив для микроцентрифужных пробирок объемом 1,5-2 мл;
3. Пробирки в стрипах либо 96-луночный планшет объемами 0,2 мл;
4. Автоматические дозаторы переменного объема на 0,5-10 мкл, 2-20 мкл, 20-200 мкл, 100-1000 мкл и соответствующие одноразовые наконечники;
5. Вортекс;
6. Центрифуга для пробирок в стрипах объемом 0,2 мл либо для 96-луночных планшетов;
7. Амплификатор;
8. Магнитный штатив.

1. Магнитные частицы для селективной очистки ДНК, например, «Smart beads» Raissol™ (#smartb 50/120/240), или аналоги технологии SPRI;
2. Деионизированная вода;
3. ТЕ буфер с низким содержанием ЭДТА;
4. 80% этанол;
5. Праймеры – комплект индексов 1 (#Plate1_SG_GM);
6. Праймеры – комплект индексов 2 (#Plate2_SG_GM).