Набор для приготовления библиотек из ампликонов «SG GM Ampli»
Раздел: Наборы для приготовления ДНК библиотек
1. 3в1 буфер;
2. 3-фермент А;
3. Лигазный буфер;
4. Лигаза;
5. Адаптеры;
6. ПЦР буфер;
7. ПЦР фермент 1;
8. ПЦР фермент 2.
Скачать краткую инструкцию "SG GM Ampli" (pdf)
Скачать полную инструкцию "SG GM Ampli" (pdf)
Проведение процедуры приготовления библиотек
Репарация
1. Внести 10 мкл очищенных фрагментов ДНК с концентрацией от 1 до 10 нг/мкл в пробирки в стрипах, либо в 96-луночный планшет объемом 0,2 мл. Концентрация для ампликонов должна быть установлена спектрофотометрически с применением интеркаляторов (#spectrahs-100/500/1000; #spectrabr-100/500/1000).
2. Приготовить мастер-микс на необходимое количество реакций:
3. Перемешать мастер-микс, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
4. Внести 15 мкл мастер-микса к образцам.
5. Поместить пробирки в амплификатор с предварительно установленной программой для репарации после выхода прибора в рабочее состояние 1-го этапа:
6. После установки пробирок в амплификатор необходимо пропустить первый этап.
Лигирование
1. Приготовить мастер-микс на необходимое количество реакций:
2. Перемешать мастер-микс, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
3. После завершения программы репарации, внести 25 мкл мастер-микса к образцам.
4. Установить программу для лигирования. Поместить пробирки в амплификатор с предварительно установленной программой для лигирования после выхода прибора в рабочее состояние 1-го этапа:
5. После установки пробирок в амплификатор необходимо пропустить первый этап.
Очистка после лигирования
1. К образцам, содержащим фрагменты <150 п.н., добавить 60 мкл магнитных частиц, к образцам, содержащим фрагменты >150 п.н., добавить 50 мкл магнитных частиц, интенсивно перемешать на вортексе до гомогенного состояния, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
2. Поместить образцы на магнитный штатив, инкубировать в течение 3-5 минут до прозрачности раствора.
3. Аккуратно, не задевая частицы, удалить супернатант.
4. Добавить 180 мкл 80% этанола к каждому образцу, инкубировать в течение 30 секунд, перемещая пробирки на магнитном штативе, меняя их положение относительно магнита. Аккуратно, не задевая частицы, удалить супернатант.
5. Повторить пункт 4. Высушить образцы с открытыми крышками при комнатной температуре в течение 10 минут или при +37°С до полного испарения спирта.
6. Добавить 24 мкл деионизированной воды к магнитным частицам. Интенсивно перемешать пробирки на вортексе, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
7. Поместить образцы на магнитный штатив, инкубировать в течение 2-3 минут до прозрачности раствора.
8. Перенести 22 мкл элюата в новые пробирки, не захватывая магнитные частицы.
Постановка индексной ПЦР
1. Добавить к каждому образцу по 2 мкл индивидуального праймерного микса из планшета с праймерами (#Plate1_SG_GM/#Plate2_SG_GM).
2. Приготовить мастер-микс на необходимое количество реакций:
3. Перемешать мастер-микс, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
4. Внести по 26,25 мкл мастер-микса к образцам.
5. Поместить пробирки в амплификатор. Запустить программу для индексной ПЦР:
Очистка после индексной ПЦР
1. К образцам, содержащим фрагменты <150 п.н., добавить 60 мкл магнитных частиц, к образцам, содержащим фрагменты >150 п.н., добавить 50 мкл магнитных частиц, интенсивно перемешать на вортексе до гомогенного состояния, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
2. Поместить образцы на магнитный штатив, инкубировать в течение 3-5 минут до прозрачности раствора.
3. Аккуратно, не задевая частицы, удалить супернатант.
4. Добавить 180 мкл 80% этанола к каждому образцу, инкубировать в течение 30 секунд, перемещая пробирки на магнитном штативе. Аккуратно, не задевая частицы, удалить супернатант.
5. Повторить пункт 4. Высушить образцы с открытыми крышками при комнатной температуре в течение 10 минут или при +37°С до полного испарения спирта.
6. Добавить 22 мкл TE буфера с низким содержанием ЭДТА к осадку частиц. Интенсивно перемешать пробирки на вортексе, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
7. Поместить образцы на магнитный штатив, инкубировать в течение 2-3 минут до прозрачности раствора.
8. Перенести 20 мкл элюата в новые пробирки. Полученные ДНК библиотеки могут храниться при +4℃ в течение суток или при -20℃ более длительный срок. ДНК библиотеки могут быть использованы в дальнейшей подготовке к секвенированию.
- Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5-2 мл;
- Штатив для микроцентрифужных пробирок объемом 1,5-2 мл;
- Пробирки в стрипах либо 96-луночный планшет объемами 0,2 мл;
- Автоматические дозаторы переменного объема на 0,5-10 мкл, 2-20 мкл, 20-200 мкл, 100-1000 мкл и соответствующие одноразовые наконечники;
- Вортекс;
- Центрифуга для пробирок в стрипах объемом 0,2 мл либо для 96-луночных планшетов;
- Амплификатор;
- Магнитный штатив.
- Магнитные частицы для селективной очистки ДНК, например, «Smart beads» Raissol™ (#smartb 50/120/240), или аналоги технологии SPRI;
- Деионизированная вода;
- ТЕ буфер с низким содержанием ЭДТА;
- 80% этанол;
- Праймеры – комплект индексов 1 (#Plate1_SG_GM);
- Праймеры – комплект индексов 2 (#Plate2_SG_GM).
© 2024 ООО «Сесана». Политика конфиденциальности и обработки персональных данных
