Набор для приготовления полногеномных библиотек размером более 300 п.н. «SG GM Maxi»

В набор включены все необходимые реагенты для приготовления полногеномных библиотек:
1.      3в1 буфер;
2.      3-фермент;
3.      ДНК-нуклеаза;
4.      Лигазный буфер;
5.      Лигаза;
6.      Адаптеры;
7.      ПЦР буфер;
8.      ПЦР фермент 1;
9.      ПЦР фермент 2.

Скачать краткую инструкцию "Shot Gun GM Maxi" (pdf)

Скачать полную инструкцию "Shot Gun GM Maxi" (pdf)

Проведение процедуры приготовления полногеномных библиотек

Фрагментация
1.      Внести 10 мкл образца ДНК с концентрацией 30 нг/мкл в пробирки в стрипах либо в 96-луночный планшет объемом 0,2 мл. Концентрация должна быть установлена: спектрофотометрически при длине волны 260 нм.
2.      Приготовить мастер-микс на необходимое количество реакций:
3в1 буфер 13,4 мкл на 1 реакцию
3-фермент 1,6 мкл на 1 реакцию
ДНК-нуклеаза 1 мкл на 1 реакцию
3.      Перемешать мастер-микс, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
4.      Внести 16 мкл мастер-микса к образцам.
5.      Поместить пробирки в амплификатор с предварительно установленной программой для фрагментации после выхода прибора в рабочее состояние 1-го этапа:

6.      После установки пробирок в амплификатор необходимо пропустить первый этап.
Примечание: рекомендованная программа рассчитана на средний размер продукта 300-350 п.н.

Лигирование
1.      Приготовить мастер-микс на необходимое количество реакций:
Лигазный буфер 20,5 мкл на 1 реакцию
Адаптеры 3,5 мкл на 1 реакцию
Лигаза 1 мкл на 1 реакцию
2.      Перемешать мастер-микс, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
3.      После завершения программы фрагментации внести 25 мкл мастер-микса к образцам.
4.      Установить программу для лигирования. Поместить пробирки в амплификатор с предварительно установленной программой для лигирования после выхода прибора в рабочее состояние 1-го этапа:

5.      После установки пробирок в амплификатор необходимо пропустить первый этап.

Очистка после лигирования
1.      Добавить 35 мкл магнитных частиц к каждому образцу, интенсивно перемешать на вортексе до гомогенного состояния, инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
2.      Поместить образцы на магнитный штатив, инкубировать в течение 3-5 минут до прозрачности раствора.
3.      Аккуратно, не задевая осадок частиц, удалить супернатант.
4.      Добавить 180 мкл 80% этанола к каждому образцу, инкубировать в течение 30 секунд, перемещая пробирки на магнитном штативе, меняя их положение относительно магнита. Аккуратно, не задевая частицы, удалить супернатант.
5.      Повторить пункт 4. Высушить образцы с открытыми крышками при комнатной температуре в течение 10 минут или при +37℃ до полного испарения спирта.
6.      Добавить 24 мкл деионизированной воды к осадку частиц. Интенсивно перемешать пробирки на вортексе, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
7.      Поместить образцы на магнитный штатив, инкубировать в течение 2-3 минут до прозрачности раствора.
8.      Перенести 22 мкл элюата в новые пробирки, не захватывая магнитные частицы.

Постановка индексной ПЦР
1.      Добавить к каждому образцу по 2 мкл индивидуального праймерного микса из планшета с праймерами (#Plate1_SG_GM/#Plate2_SG_GM).
2.      Приготовить мастер-микс на необходимое количество реакций:
ПЦР буфер 25 мкл на 1 реакцию
ПЦР фермент 1 0,5 мкл на 1 реакцию
ПЦР фермент 2 0,75 мкл на 1 реакцию
3.      Перемешать мастер-микс, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
4.      Внести по 26,25 мкл мастер-микса к образцам.
5.      Поместить пробирки в амплификатор. Запустить программу для индексной ПЦР:

Очистка после индексной ПЦР
1.      Добавить 35 мкл магнитных частиц к каждому образцу, интенсивно перемешать на вортексе до гомогенного состояния, инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
2.      Поместить образцы на магнитный штатив, инкубировать в течение 3-5 минут до прозрачности раствора.
3.      Аккуратно, не задевая осадок частиц, удалить супернатант.
4.      Добавить 180 мкл 80% этанола к каждому образцу, инкубировать в течение 30 секунд, перемещая пробирки на магнитном штативе. Аккуратно, не задевая осадок частиц, удалить супернатант.
5.      Повторить пункт 4. Высушить образцы с открытыми крышками при комнатной температуре в течение 10 минут или при +37℃ до полного испарения спирта.
6.      Добавить 22 мкл TE буфера с низким содержанием ЭДТА к осадку частиц. Интенсивно перемешать пробирки на вортексе, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
7.      Поместить образцы на магнитный штатив, инкубировать в течение 2-3 минут до прозрачности раствора.
8.      Перенести 20 мкл элюата в новые пробирки.

Все реагенты набора «SG GM Maxi» необходимо хранить при температуре от -20℃ до -15℃, срок хранения составляет 12 месяцев.
Полученные полногеномные библиотеки могут храниться при +4℃ в течение суток или при -20℃ более длительный срок.

Необходимые материалы и оборудование:

1. Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5-2 мл;
2. Штатив для микроцентрифужных пробирок объемом 1,5-2 мл;
3. Пробирки в стрипах либо 96-луночный планшет объемами 0,2 мл;
4. Автоматические дозаторы переменного объема на 0,5-10 мкл, 2-20 мкл, 20-200 мкл, 100-1000 мкл и соответствующие одноразовые наконечники;
5. Вортекс;
6. Центрифуга для пробирок в стрипах объемом 0,2 мл;
7. Амплификатор; магнитный штатив планшетного типа для пробирок объемом 0,2 мл.

Необходимые реагенты:

1. Магнитные частицы для селективной очистки ДНК, например, «Smart beads» Raissol™ (#smartb 50/120/240), или аналоги технологии SPRI;
2. Деионизированная вода;
3. ТЕ буфер с низким содержанием ЭДТА;
4. 80% этанол;
5. Праймеры – комплект индексов 1 (#Plate1_SG_GM); праймеры – комплект индексов 2 (#Plate2_SG_GM).