Набор для приготовления полногеномных библиотек «SG GM Plus»

Проведение процедуры приготовления полногеномных библиотек

Фрагментация

1.    Внести 10 мкл образца ДНК с концентрацией 20 нг/мкл (для геномной ДНК) или 10 нг/мкл (для ампликонов) в пробирки в стрипах либо в 96-луночный планшет объемами 0,2 мл. Концентрация должна быть установлена: 1) для геномной ДНК – спектрофотометрически при длине волны 260 нм 2) для ампликонов – спектрофотометрически с применением интеркаляторов (#spectrahs-100/500/1000; #spectrabr-100/500/1000).

2.    Приготовить мастер-микс на необходимое количество реакций:

3в1 буфер - 13,4 мкл на 1 реакцию.

3-фермент - 1,6 мкл на 1 реакцию.

ДНК-нуклеаза - 1 мкл на 1 реакцию.

3.    Перемешать мастер-микс, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.

4.    Внести 16 мкл мастер-микса к образцам.

5.    Поместить пробирки в амплификатор с предварительно установленной программой для фрагментации после выхода прибора в рабочее состояние 1-го этапа:

6.    После установки пробирок в амплификатор необходимо пропустить первый этап.

Примечание: при использовании ДНК-нуклеазы для фрагментирования ДНК на необходимый размер, следует провести предварительное тестирование времени фрагментации (полка 2: +65℃) с шагом 2,5 минуты для установления оптимального размера (уменьшение времени приводит к увеличению размера продукта). Рекомендованная программа рассчитана на средний размер продукта 140-160 п.н.

Лигирование

1.    Приготовить мастер-микс на необходимое количество реакций:

Лигазный буфер - 20,5 мкл на 1 реакцию.

Адаптеры - 3,5 мкл на 1 реакцию.

Лигаза - 1 мкл на 1 реакцию.

2.    Перемешать мастер-микс, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.

3.    После завершения программы фрагментации внести 25 мкл мастер-микса к образцам.

4.    Установить программу для лигирования. Поместить пробирки в амплификатор с предварительно установленной программой для лигирования после выхода прибора в рабочее состояние 1-го этапа:

5.    После установки пробирок в амплификатор необходимо пропустить первый этап.

Очистка после лигирования

1.    Добавить 45 мкл магнитных частиц к каждому образцу, интенсивно перемешать на вортексе до гомогенного состояния, инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.

2.    Поместить образцы на магнитный штатив, инкубировать в течение 3-5 минут до прозрачности раствора.

3.    Аккуратно, не задевая осадок частиц, удалить супернатант.

4.    Повторно центрифугировать образцы на максимальных оборотах центрифуги в течение 10-20 с.

5.    Поместить образцы на магнитный штатив, аккуратно, не задевая осадок частиц, максимально удалить остатки супернатанта.

6.    Добавить 24 мкл элюирующего буфера к осадку частиц. Интенсивно перемешать пробирки на вортексе, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.

7.    Поместить образцы на магнитный штатив, инкубировать в течение 2-3 минут до прозрачности раствора.

8.    Перенести 22 мкл элюата в новые пробирки, не захватывая магнитные частицы.

Постановка индексной ПЦР

1.    Добавить к каждому образцу по 2 мкл индивидуального праймерного микса из планшета с праймерами (#Plate1_SG_GM/#Plate2_SG_GM).

2.    Приготовить мастер-микс на необходимое количество реакций:

ПЦР буфер - 25 мкл на 1 реакцию.

ПЦР фермент 1 - 0,5 мкл на 1 реакцию.

ПЦР фермент 2 - 0,75 мкл на 1 реакцию.

3.    Перемешать мастер-микс, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.

4.    Внести по 26,25 мкл мастер-микса к образцам.

5.    Поместить пробирки в амплификатор. Запустить программу для индексной ПЦР:

Очистка после индексной ПЦР

1.    Добавить 50 мкл магнитных частиц к каждому образцу, интенсивно перемешать на вортексе до гомогенного состояния, инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.

2.    Поместить образцы на магнитный штатив, инкубировать в течение 3-5 минут до прозрачности раствора.

3.    Аккуратно, не задевая осадок частиц, удалить супернатант.

4.    Добавить 180 мкл 80% этанола к каждому образцу, инкубировать в течение 30 секунд, перемещая пробирки на магнитном штативе. Аккуратно, не задевая осадок частиц, удалить супернатант.

5.    Повторить пункт 4. Высушить образцы с открытыми крышками при комнатной температуре в течение 10 минут или при +37°С до полного испарения спирта.

6.    Добавить 22 мкл элюирующего буфера к осадку частиц. Интенсивно перемешать пробирки на вортексе, сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.

7.    Поместить образцы на магнитный штатив, инкубировать в течение 2-3 минут до прозрачности раствора.

8.    Перенести 20 мкл элюата в новые пробирки.

Полученные полногеномные библиотеки могут храниться при +4℃ в течение суток или при -20℃ более длительный срок. Полногеномные библиотеки могут быть использованы в дальнейшей подготовке к секвенированию.

Скачать краткую инструкцию "SG GM Plus" (pdf)

Скачать полную инструкцию "SG GM Plus" (pdf)

вернуться в каталог товаров

1. Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5-2 мл;
2. Штатив для микроцентрифужных пробирок объемом 1,5-2 мл;
3. Пробирки в стрипах либо 96-луночный планшет объемами 0,2 мл;
4. Автоматические дозаторы переменного объема на 0,5-10 мкл, 2-20 мкл, 20-200 мкл, 100-1000 мкл и соответствующие одноразовые наконечники;
5. Вортекс;
6. Центрифуга для пробирок в стрипах объемом 0,2 мл либо для 96-луночных планшетов;
7. Амплификатор;
8. Магнитный штатив планшетного типа для пробирок объемом 0,2 мл.

1. 80% этанол;
2. Праймеры – комплект индексов 1 (#Plate1_SG_GM),
3. Праймеры – комплект индексов 2 (#Plate2_SG_GM).