Цифровая ПЦР

Подробнее о том, как устроен метод

Данные dPCR позволяют идентифицировать отдельные молекулы для абсолютного количественного определения, в то время как традиционная ПЦР измеряет плато, отображая переменные результаты из-за изменений в кинетике реакции.

dPCR основана на разделении образца ДНК, кДНК или РНК на множество отдельных микрореакций; некоторые микрореакции содержат одну или несколько молекул, а другие не содержат ни одной. Каждая микрореакция подвергается ПЦР-амплификации и анализу отдельно. Микрореакции с амплифицированным продуктом и без него подсчитывают индивидуально. Те, которые содержат амплифицированный продукт, считаются положительными; те, в которых его нет, считаются отрицательными.

Микрофлюидный планшет представляет собой удобный и простой расходный компонент для параллельного проведения тысяч микрореакций. В каждую лунку планшета загружают смесь образца, мастер-микса (в него обычно входит ДНК-полимераза, буфер для проведения реакции и дезоксинуклеотидтрифосфаты) и реагентов и, после распределения по микрореакциям, индивидуально анализируют на наличие или отсутствие сигнала конечной точки. После ПЦР-анализа фракция отрицательных микрореакций используется для подсчета абсолютного количества целевых молекул в образце без стандартов или эндогенного контроля.

Из-за случайного распределения ПЦР-смеси нет никакой гарантии, что в каждой положительной реакции находится только одна молекула целевого продукта. Именно поэтому для последующего анализа результатов применяется определенная модель расчета — модель Пуассона.. Для ее использования должна быть хотя бы одна отрицательная реакция — реакция без молекул. Важно отметить, что при использовании модели Пуассона отрицательные реакции имеют наибольшее значение. Они помогают установить не только количество молекул ДНК, присутствующих в исходном образце, но и соотношение положительных и отрицательных реакций после ПЦР-анализа. Модель Пуассона описывает вероятность того, что реакция получит ноль, одну, две или три копии. Она учитывает отдельные реакции, которые могут содержать разное количество молекул, и обеспечивает получение правильного ответа. В результате оцифровка образцов в сочетании со статистическим анализом данных Пуассона обеспечивает более высокую точность, чем традиционные методы ПЦР.

Приложения для метода

Цифровая ПЦР работает с широким спектром приложений. Метод хорошо подходит для:

• Определения вариации числа копий генов (CNV);
  
• Количественной оценки библиотеки секвенирования следующего поколения (NGS)
  
• Количественной оценки редких генетических мишеней;
  
• Количественного определения титра вируса;
  
• Обнаружения патогенов в окружающей среде.
  

Прежде всего, dPCR обеспечивает механизм абсолютного количественного определения, который позволяет вам определить количество молекул в образце без необходимости использования стандартной кривой. Это особенно важно для клинических лабораторий и анализа экспрессии генов. Также, dPCR позволяет идентифицировать редкий вариант среди подавляющего числа нормальных аллелей, например, выявлять онкогенные мутации в циркулирующей свободной ДНК. Также PCR менее чувствительна к таким ингибиторам, как SDS или гепарин, чем реакции кПЦР.

Источник
"What Is Digital PCR?" / Scientific Thermo Fisher, 2015. URL: https://www.thermofisher.com/ru/ru/home.htm